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实验七 分子水平检测食品中的病原微生物 目的与要求 了解聚合酶链式反应法快速检测食品中病原微生物的实验方法 学习英语PCR检测法检测沙门菌的实验方法，掌握本实验的操作要点 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是在体外对特定的双链DNA片段进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。该法首先是将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入两段人工合成的与靶DNA两端互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物。该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后，在有DNA聚合物和4种dNTPs底物存在的情况下，引物沿模板DNA链按5’端→3’端方向延伸，自动合成新的DNA双链。新合成DNA双链又可作为扩增的模板，继续重复以上的DNA多聚酶链反应。经过25~35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。 仪器与试剂 仪器 匀质器；振荡器；电子天平；冰箱；恒温培养箱；无菌锥形瓶；无菌试管；PCR仪；电泳装置；凝胶分析成像系统；高速离心机。 试剂 试剂盒组成：DNA提取液；Tris饱和酚；三氯甲烷；亚硫酸铋（BS）琼脂；HE（Hektoen Enteric）琼脂；木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂；科玛嘉沙门菌属显色培养基；PCR反应液；PCR检测试剂盒；琼脂糖；50×TAE缓冲液；DNA分子量标记物（100～1000bp）；10×PCR缓冲液。 实验步骤 样品的制备、增菌和分离 称取25g（ml）样品放入盛有225ml缓冲蛋白胨水（BPW）的无菌匀质杯中，以8000～10000r/min匀质1～2min，若样品为液态，则不需要匀质，震荡混匀。如需要测定pH值，用1mol/ml无菌氢氧化钠或盐酸调节pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转移至500ml锥形瓶中，如使用匀质袋，可直接进行培养，于（36±1）℃培养8～18h。 轻轻摇动培养过的样品混合物，取1ml转种于10ml四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）内，于（42±1）℃培养18～24h。同时，另取1ml转接于10ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）内，于（36±1）℃培养18～24h。 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或嘉显色培养基平板）上。于（36±1）℃分别培养BS琼脂平板40～48h和XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或嘉显色培养基平板）18～24h，观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征如表5-3所示。 细菌模板DNA的提取 表5-3 菌落特征对照表 琼脂平板 沙门菌菌落特征 BS琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变 XLD琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌落可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心 HE琼脂 菌落呈蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色 嘉显色培养基 菌落为紫红色 直接提取法 取1ml培养的增菌液加入1.5ml的离心试管中，8000r/min离心分离5min，除去上层清液；加入50ulDNA提取液，混匀后沸水浴5min，12000r/min离心分离5min，取上层清液保存于-20℃备用待检，取分离到的可疑菌落，加入50ulDNA提取液，重复上述操作步骤制备模板DNA以待检。 有机溶剂提纯法 取1ml’培养的增菌液加入1.5ml的离心管中， 8000r/min离心分离4min，除去上层清液；加入75ulDNA提取液，混匀后沸水浴5min，加入700ul酚-三氯甲烷（1:1），震荡均匀，13000r/min离心分离5min，除去上层清液，加入70﹪乙醇溶液洗涤，13000r/min离心分离5min，沉淀置于20ul核酸溶解液中，保存于-20℃备用待检。 PCR扩增 引物的序列见表5-4 表5-4 PCR检测沙门菌的引物序列 病原菌 引物名称 引物序列 扩增片段 沙门菌 invA 5’-gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa-3’ 5’-tca tcg cac cgt caa agg aac c-3’ 284bp 对照设置。空白对照为以水代替DNA模板；阴性对照采用非目标菌的DNA作为PCR反应的模板；阳性对照采用含有检测序列的DNA作为PCR反应的模板。 将抗体与等量样品提取液在玻璃试管内混合震荡后，室温下静置15min。启封酶标板，用洗液2×3min洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体-抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴性对照液（3孔），130ul/孔，37℃湿盒中孵育（或加盖以保持相对湿度），2h后，倒掉反应液并拍干，用洗液3×3min洗板，拍干