荧光标记的突变型淀粉样前体蛋白裂解过程的细胞研究.pdfVIP

生堡控经型盘查!塑!堡!旦筮!!鲞筮!翅g!垫』塑!!望!：丛型!!!!!：y尘：垒!上_堕生土 ．基础研究． 荧光标记的突变型淀粉样前体蛋白 裂解过程的细胞研究 李晓晴张苏明 骆清铭 张昊张智红 薛峥 【摘要】 目的 研究淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein，APP)酶解过程，构建含有 swedish和APP717两种突变的荧光真核表达系统。方法以pcDNA3．0．APP为模板，通过聚合酶链 酶切产物为模板，通过PcR分别得到编码蓝色荧光蛋白(cFP)和黄色荧光蛋白(YFP)碱基序列；生一 物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54bp)。利用基因工程技术将cFP、54bp、YFP、 c99片段克隆至载体质粒pcDNA3．0中，通过酶切、PcR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3．0一cFP一 54bp—YFP．c99和pcDNA3．0一cFP．54bp-YFP，并将其转染至人神经母细胞瘤(SH—sY5Y)细胞中，利用 多光子共聚焦显微镜观察荧光表达，检测荧光共振能量转移(FRET)以及免疫细胞化学染色观察B 淀粉样蛋白(AB)。结果(1)基因序列分析证明重组质粒构建成功。(2)利用多光子共聚焦显微镜 观察转染细胞，显示融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光。(3)表达cFP-54bp—YFP的细胞有 FRET现象，而表达cFP-54bp—YFP—c99的细胞中观察不到FRET现象。(4)利用多光子共聚焦显微镜 发现cFP-54bp—YFP—c99转染的细胞中有YFP标记的A8产生并沉积在胞质胞膜以及细胞间隙中。 (5)免疫细胞化学检测证实cFP一54bp—YFP—c99经过裂解可以产生AB，Ap在细胞膜、细胞质、细胞间 隙聚集沉积。结论 (1)融合基因的表达产物能够完成APP的有序裂解产生AB。(2)Ap有可能产 生于APP由胞质至胞膜的运输过程中。(3)研究显示c99对于APP被裂解有重要意义，可能起到信 号肽样的引导定位作用。(4)在细胞外形成沉积之前，AB已经在细胞内聚集导致细胞形态改变。 【关键词】淀粉样B蛋白前体；荧光共振能量转移；显微镜检查，共焦；转染 ofmutant labelednuorescentinceus Cleavage amyloidprecursorprotein by protein Ⅱ施∞一ging‘， 4 zHANG M讥，zHANGzht—hong，XUEzheTLg． su·rning，LUoQ流g—ming，ZHANG Depnnmem《 ⅣeurofDgy，％n觑舶印i￡oZ，乃n∥肘ed记口Zcof如鲈，舰n如。昭‰西e瑙毋o，如聊e。以死cA加209y，阢也on 430030．Ckn8 To the of objective 【Abst瑚Ict】 studyenzymaticpmgressaⅡlyloidprecursorpmtein(APP)，and constmcttIlerecombinant thedoublemutationsofAPPaIld2 eukar)roticexpres8ionplasmidencoding di舶rent ofnuorescent Thelast300basesofAPPnamedasC99 APP717 tvpes protein．Methods containing mutationwas chain the reaction(PCR)with amplifiedbypolymera8e tenlplatepcDNA3．0一APP．ThecyaJl