CHFR和Runx3基因表达及启动子甲基化和胃癌病理生物学特征关系及机制研究.pdf

·中文论著摘要· CHFR和Runx3基因表达及启动子甲基化与 胃癌病理生物学特征的关系及机制研究 目 的 胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。与其他恶性肿瘤一样，胃癌的发生是 多基因、多阶段变异累积形成的病理过程。这些基因主要是癌基因、抑癌基因及 DNA错配修复基因等。抑癌基因功能的丢失可以通过多种途径，除基因突变和 杂合性丢失外还与其启动子发生甲基化修饰有关。DNA甲基化是指在DNA甲基 转移酶(DNA 真核生物染色体DNA甲基化是基因表达调控的一种方式。DNA异常甲基化可引 起染色体结构、DNA稳定性的改变和基因表达异常，影响细胞的增殖和分化。 真核生物DNA甲基化水平与肿瘤关系密切。启动子区高甲基化能导致抑癌基因 表达沉默，这是肿瘤发生的关键事件。新近研究证实，CHFR是重要的肿瘤抑制 降解，阻断细胞进入有丝分裂中前期。CHFR基因在人正常组织中普遍表达，在 一些肿瘤中表现为失活或低表达，因而不能阻断异常细胞通过G2期进入有丝分 factor3 transcription 调节因子，TGF．p是多种细胞生长的有效抑制因子，TGF．p信号转导通路的紊乱 可导致多种肿瘤的发生。 本研究采用MSP、RT-PCR、Western blotting及免疫组化(mC)技术，检 测人胃癌组织及其配对正常胃黏膜CHFR及Runx3基因的甲基化状态、mRNA 和蛋白的表达水平，观察分析CHFR及Runx3基因异常甲基化与其mRNA表 达水平和蛋白表达的关系，探讨胃癌组织中CHFR及Runx3基因启动子甲基化 和mRNA表达异常与胃癌病理生物学特征的关系，为阐释抑癌基因CHFR及 Runx3在胃癌发生发展中的作用及其分子机理提供新的科学实验依据。 实验材料和方法 1、研究对象 本实验研究对象收集2003．12至2004．05中国医科大学附属第一医院肿瘤科 及辽宁省肿瘤医院外科手术切除胃癌常规病理组织标本151例。另外，收集 2007年3月至9月辽宁省肿瘤医院肿瘤外科手术切除之新鲜胃癌组织及其配对 远端的正常胃粘膜组织(距胃癌灶边缘5cm处)标本共36例，迅速置于液氮内 冷冻，然后储存于．70(2冰箱中保存待用。所有病例均经病理检查确定诊断，所 有胃癌患者术前均未经化疗和放疗。选择胃癌和其配对正常胃粘膜组织资料完整 的20个病例用于实验。 2、实验方法 (1)胃癌组织芯片制作 采用组织芯片制作仪(Microarrayer，Beecher 片。构建完成胃癌及其癌前病变的组织微阵列石蜡块l、2、3、4和5(蜡块l： 含117个组织芯；蜡块2：含109个组织芯；蜡块3：含110个组织芯；蜡块4： 含101个组织芯；蜡块5：含124个组织芯)。将组织芯片蜡块行连续切片，切片 厚度为4岬，用于免疫组织化学染色的切片裱于经O．1％多聚赖氨酸防脱片处理 的载玻片上，60℃烤片1h，58℃中继续烤片18h，常温保存备用。 (2)免疫组化染色检测CHFR和mP53蛋白表达 采用Envision方法对胃癌及其癌前病变组织芯片进行免疫组化染色。 人P53单克隆抗体(即用型)分别购自Abnova公司和北京中杉金桥生物技术有限 作为阴性对照。 免疫组化染色结果判定：CHFR和mP53蛋白免疫染色阳性信号分别定位于 2 细胞浆和胞核，呈棕黄色颗粒，每个标本观察2个有代表性的高倍视野，每个视 野计数100个细胞确定阳性细胞数所占的百分比并取它们的平均值，阳性细胞数 420％为阴性(·)，阳性细胞数20％为阳性(+)。 (3)RToPCR法检测CHFR和Runx3基因mRNA表达 PCR为内参照。 CHFR和Runx3基因引物进行PCR扩增，以p-actin (4)MSP检测CHFR和Runx3基因甲基化状态 Genomic血液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒提取组织 采用TIANamp 基因甲基化及非甲基化引物进行扩增。 (5)Western Blot检测CHFR和Runx3基因编