CRISPR特异性—克服CRISPR脱靶效应.pdfVIP

CRISPR-Cas9Specificity:Tamingoff-targetMutagenesis EdDavis,Ph.D 摘要 基因组编辑：对复杂有机体基因组特定位点进行操作，实现突变、插入或缺失等改变。这一 系列操作对生物学和药学的发展至关重要 （BogdanoveVoytas,2011;vanderOost,etal., 2013 ）。近两年，CRISPR (Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats)-Cas(CRISPR-associated)系统逐渐被用于基因敲除，特定碱基的精确改变，以及 转基因等等。 CRISPR-Cas系统具有许多优势：设计简单，高效率和相对更低的成本花费。与传统方法 相比，更加重要的是它能够纠正引起遗传疾病发生的突变，避免由随机整合引起的错误。然 而，CRSIPR-Cas9本身具有脱靶突变的倾向性。虽然目前该技术已得到较大改进，但一些 研究者仍然认为CRISPR-Cas 的特异性相对较低。此文中，我们将讨论CRISPR-Cas在基 因组编辑应用中的作用机制以及影响其特异性的因素，文献所报道的CRISPR潜在的脱靶 突变，增强 CRISPR-Cas 靶特异性的方法，以及 GeneCopoeia 提供的用于增强 CRISPR-Cas特异性的解决方案。 CRISPR-Cas 靶向识别能力 广泛应用于基因组编辑的 CRISPR-Cas 包含两部分：1）源自链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9核酸酶；2）AsingleguideRNA(sgRNA).sgRNA是CRISPR靶向识 别系统中两个 RNA 分子的嵌合体（Jinek, et al. 2012）： CRISPR RNA (crRNA)和 transactivatingCRISPRRNA(tracrRNA; 图1)。一个sgRNA包含20个具有靶位点特异性 的核苷酸可变区域。另外，Cas9与靶序列的特异结合需要识别3nt 的N-G-G序列，即 PAM(ProtospacerAdjacent Motif)。 图1. 链球菌Cas9 核酸酶的结合与剪切功能的实现需要具有靶序列特异性的crRNA 和结构特异性的 tracrRNA 的辅助。图中黄色高亮是靶序列结合位点。PAM位点是灰色部分。箭头显示将被核酸酶切割的位 置。红色箭头是最常切割的位点。在基因组编辑实际应用过程中，可将crRNA和tracrRNA融合成一个sgRNA. Jinek,etal.(2012). 当sgRNA与Cas9形成复合物，复合物定位到靶序列和PAM位点，靶DNA解链，长20nt 的guideRNA退火与反义链互补配对。最后，在Cas9核酸酶作用下，靶DNA双链断裂（DSB, 图1）。若DSBs未被立即修复，细胞将会死亡。细胞所偏好的DSB修复途径是同源重组作 用下的相对无错误修复机制，但这种机制几乎不存在于有丝分裂的细胞，因为它必须存在于 分裂后期 — 染色体复制和姐妹染色单体配对之后。并且，同源重组通常不存在于非分裂细 胞中。除了同源重组，DSB通过非同源末端连接（Non-HomologousEndJoining,NHEJ）进 行修复。NHEJ极易发生错误，从而导致序列插入或缺失突变，如同断裂的染色体末端重新 拼接到一起。CRISPR-Cas作为一种简单、高效的基因敲除工具，被研究者用于探究基因插 入或缺失的倾向性。 图2. 基因组编辑工具诱导的DSBs修复方法。左：非同源末端连接。右：供体模板存在下的同源重组。 sgRNA的结合特异性 考虑到CRISPR-Cas9 的靶向识别序列长度为20nt，因此，如果RNA与染色体靶位点的结合 是严格以序列为依据，这些靶位点在真核基因组中应该是独一无二的，再加上需要识别PAM 位点，CRISPR-Cas错误切割的可能性极低。 但是，影响CRISPR特异性的因素不只是序列。YanfangFu和他的同事研究得出：即使形成 了一个或多个错配，sgRNAs仍然能够引导Cas9核酸酶作用于被整合到染色体上的GFP报 告基因的3个不同的靶点（Fu,etal.,2013）。GuideRNAs和靶序列之间分散存在的或紧邻 的多个错配都是可以接受的。GuideRNA 中靠近PAM位点的 10个核苷酸中的错配比远离 PAM位点的 10个核苷酸中的错配更容易被接