反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立.pdfVIP

438 中国医药生物技术 2010 年 12 月第 5 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2010, Vol. 5, No. 6 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.008 ·论著· 反转录酶活性检测实时荧光定量 PCR 方法的建立 孔艳，吴小红，杨立宏，安祺，董关木，俞永新 【摘要】 特点。目前已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、 目的 在传统产物增强性反转录酶（PERT ）活性检测方法 免疫分析以及基因表达、突变和多态性研究等多个 基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量 PCR 方法。 领域。 方法 以噬菌体 MS2 RNA 为模板，设计、合成引物和探 反转录酶是所有反转录病毒的一个重要标志， 针，并分别以连续 10 倍倍比稀释的 AMV 反转录酶（1 × 目前普遍应用的检测反转录病毒方法是以 PCR 为 -1 -9 基础的产物增强性反转录酶（product enhanced 10 ~ 1 × 10 U/μl ）标准品催化体外反转录反应合成相应 cDNA 。采用实时荧光定量 PCR 法检测底物 cDNA 模板 reverse transcriptase ，PERT ）活性检测法。我们曾 量，并获得相应的 PCR 荧光值曲线，分析 AMV 反转录 经在国内首次报道了反转录酶的 PERT 检测方法， 酶的相对活性。同时应用传统 PERT 方法对 cDNA 进行扩 但传统 PERT 方法在实验过程中容易造成污染和 增，测定该方法的灵敏度。 假阳性，并且无法做到实时监控。为此，我们在原 有方法的基础上[1]，以噬菌体 MS2 RNA 为模板合 结果 将 AMV 反转录酶标准品连续 10 倍倍比稀释后催 成引物和探针，尝试建立一种检测反转录酶活性的 化反转录反应，实时荧光定量 PCR 分析所得的反转录产物 实时荧光定量 PCR 方法。 cDNA，结果得到与理论值完全相符合的 PCR 标准荧光值 曲线；定量分析结果显示，浓度为 1 × 10-2 ~ 1 × 10-8 U/μl 的 1 材料与方法 AMV 反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的 1.1 材料 AMV 反转录酶，经传统 PERT 方法扩增后，结果显示浓 -3 -7 噬菌体 MS2 RNA 、反转录试剂盒、AMV 反 度为 1 × 10 ~ 1 × 10 U/μl 的 AMV 反转录酶均可见大 -7 转录酶（AMV Rtase ）、核糖核酸酶抑制剂（RNasin ） 小为 112 bp 的阳性条带，检测灵敏度达到 1 × 10 U/μl 。 均购自美国 Invitrogen 公司；定量 PCR 预混合液 结论 成功建立了基于实时荧光定量 PCR 技术的检测反 和 Applied Biosysems7500 型定量 PCR 仪购自美 转录酶活性的新方法，实验操作简单，具有高精确性和无污 国 Appl