小鼠羊膜干细胞的分离与培养.pdf

塍篮笠型!匦芏堰王塑塑盟坌离皇揸羞箜!!塑 小鼠羊膜干细胞的分离与培养 滕赞 王嫘1 李 智2 同部素典3 吉田淑子3 二睹堂敏雄3 (中国医科大学附属第一医院肿瘤内科，辽宁 沈阳 110001) [摘要]目的探索小鼠羊膜细胞(mAMcs)分离、培养方法及其体外增殖分化的特性。方法应用不同浓度胰蛋白酶及与胶原酶按不同的 先后顺序作用小鼠羊膜，并采用不同的细胞接种浓度培养细胞，分别考核最佳的分离及体外培养方案。免疫荧光及免疫组化法鉴定mAMcs的干细 胞标志。结果胰蛋白酶消化及与胶原酶合用顺序不同，导致收获上皮细胞与间质细胞的数量和比例明显不同，先用胰蛋白酶消化将得到较多的上 皮细胞，反之先用胶原酶消化将得到较多的间质细胞。以不同浓度接种上皮和间质细胞，原代培养2w后生长曲线可见原代培养的mAMcs在y轴为 对数坐标时呈长尾s型曲线。原代培养的上皮和间质细胞有较长的停滞期(2—4 d)，指数增长期的细胞倍增时间间质细胞相对上皮细胞短，因此融 medium 合期时间问质细胞明显较短。接种浓度对间质细胞的生长曲线影响不大，但对上皮细胞有较大影响。在chang C营养液中原代附壁培养 mAMcs 志0c．13／4及ssEA一1阳性。 [关键词]小鼠；羊膜干细胞；胰蛋白酶；胶原酶；0c耶／4；ssEA．1 [中图分类号]R34[文献标识码]A 人类及胎生动物的羊膜组织存在干细胞及多能分化前体， TN)、Ⅳ型胶原酶(sigma公司，美国)。 细胞多项研究证实人羊膜上皮细胞及问质细胞可在体内、体外 1．1．3 动物c57 分化为肝、心肌、胰腺等组织样细胞¨。J。而对小鼠羊膜细胞 症研究所(IcR)小鼠，由富山大学医学部动物实验中心提供。 (mAMcs)分离及培养的研究未见报道。本研究在人类羊膜干 本实验由富山大学医学部伦理委员会审议通过。 细胞研究的基础上，探索mAMcs小鼠羊膜干细胞分离及培养1．2 方法 方法，探讨mAMcs的体外增殖及分化特性，也为定向诱导分化 1．2．1 BI／6 mAMcs的制备与分离小鼠羊膜的准备：c57 药物的筛选，以及胚胎药物毒理学等研究提供新的手段。 1材料与方法 性小鼠有无阴道栓，如发现阴道栓记为妊娠第1天，取出受孕 1．1 材料 鼠单独饲养。妊娠18d后戊巴比妥腹腔注射麻醉妊娠雌鼠，剪 1．1．1 主要仪器cO：培养箱、净化工作台(SANYO，日本)； 短颈动脉处死后解剖取出子宫，游离胚胎并立即投入冷无菌生 倒置显微镜、实体解剖显微镜(0LYMPus，日本)；倒置荧光显 理盐水(4℃)。在实体解剖显微镜下将羊膜与卵黄囊小心分 DM／RBEnuorescence 微镜Leica microscope(LeicaMicmsystems 离，得到新鲜小鼠羊膜备用。mAMcs分离方法：参考人羊膜细 GmbH，Wetzlar)。 胞的分离方法、3。，本文应用不同浓度胰蛋白酶消化及与胶原酶 1．1．2 7sModi矗ed 主要试剂Dulbecco Eagle’sMedium，High— 合用的先后顺序不同考核最佳的分离方案，最终采用的 MediumC Glueose(DMEM，Sigma—Aldrich，St．Louis