PCR检测方法国家标准(论文资料).pdfVIP

ICS 11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.2—2004 H5 亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Avian Influenza Virus Subtype H5 2004-2-15 发布 2004-2-15 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 GB/T19438.2—2004 前 言 本标准是依据GB/T1.1—2000 《标准化工作导则 第1 部分：标准的结构和编写规则》制定的。 本标准的附录Ａ是本标准的资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本标准主要起草人：刘环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。 本标准系首次发布的国家标准。 I GB/T19438.2—2004 H5 亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。 本标准适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒型通用型荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准： 荧光RT-PCR 荧光反转录— 聚合酶链反应。 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 RNA 核糖核酸。 Taq酶 Taq DNA 聚合酶 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 DEPC 焦碳酸乙二酯 4 原理 采用TaqMan方法，在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血凝 素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内 部。其中5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q 表示），它在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与 目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应 进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来， 所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长， 荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 5 试剂和材料 5.1 试剂 除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 氯仿 异丙醇：-20 ℃预冷 75 %乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB6682要求）配制，-20 ℃预冷 0.01 mol/L （pH 7.2）的PBS：配方见GB/T