液相层析方法教案(第3章).pptVIP

流动相中气泡？ 原因 危害 脱气 (3)梯度淋洗装置 3 高效分离柱 液相色谱检测器 b. 光电二极管阵列检测器 c. 示差折光检测器（differential refractive index detector） 一、高压输液系统 由于HPLC所用固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备； 一般由贮液器、高压泵、梯度洗脱、脱气装置和压力表等组成； 贮液器要惰性、耐腐蚀，配有过滤器； 高压泵应密封性好、输出流量稳定、压力平稳； 梯度淋洗通过连续改变流动相极性、离子强度等使保留时间过短而峰形重叠，或过长峰形扁平宽大的组分，都获得良好的分离； 脱气采用氦气鼓泡驱除流动相中溶解的气体。 (1)流动相贮存器 超声波振荡；惰性气体鼓泡吹扫脱气；真空脱气。 流速 不稳、基线 起伏、噪音峰 尖锐、检测器问题 氧气、空气 在线真空脱气和He脱气对保留时间再现性的影响 (2)输液泵 基本要求 1 流速稳定 2 流量可调 3 耐高压 4 死体积小 5 耐腐蚀 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 二、进样装置 柱较短，能由进样系统、连接管道等存在的死体积引起柱外展宽，故进样技术要求高，有两种： 注射器进样 具有快速、简便、可任意改变进样体积等特点，但进样体积不宜过大，进样重复性欠佳，试样易渗漏； 六通阀进样 由阀芯、阀体、定量管组成，特点为进样量由选定的定量管而固定，重现性好。 2 进样装置 耐高压的六通阀进样装置 三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件； 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相； 柱温一般为室温或接近室温。 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 高效液相色谱法的主要类型 液固吸附色谱法 液液分配色谱法 化合键合色谱法 离子色谱法 分子排阻色谱法 四、检测器 检测器是HPLC的三大关键部件之一，但至今乃是一个薄弱环节；按适用性分两类： 通用型检测器　对大多数物质的响应差别不大，适用于所有物质的检测，如示差折光检测器等； 选择性检测器　对不同组成的物质响应差别极大，只能选择性地检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测器等。 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：灵敏度高； 线形范围高；流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种； 酶联免疫分析法(ELISA) 六十年代出现的新的免疫测定技术，当时主要用于临床诊断，如检测药物、蛋白和病毒，经过三十多年的不断改善和完善，已成为一种不可替代的普遍运用的分析法。 该分析法在临床诊断上的巨大成功，引起许多食品分析家的兴趣，并于七十年代末将该方法用于食品卫生分析的研究和应用。 ELISA是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机的结合起来的一种检测技术。 其主要依据有三点： ①抗原(抗体)能结合到固相载体的表面仍具有其免疫活性； ②抗体(抗原)与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性与酶的活性； ③相应的抗体(抗原)反应后结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体(抗原)的含量。 ELISA的基本原理 酶联免疫吸附试验原理 三种测定方法，即直接法、抗体夹心法和竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子。 双抗体夹心法 ELISA的特点 灵敏度高 最低检出量可达pg级，并可定量测定，而薄层层析法最低检出量只有ng； 干扰小　强的特异性 测定步骤简便快速 干扰小，特异性强，简化了样品的预处理和纯