食品微生物学基础实验之二微生物染色技术.pptVIP

实验二 微生物染色技术 一、目的和要求 1、掌握细菌涂片和染色的基本技术 2、了解革兰氏染色的机理、掌握革兰氏染 色的方法 3、掌握细菌芽孢的染色方法 4、掌握无菌操作技术 5、学会使用普通生物显微镜 二、实验原理 （1）简单染色实验原理 2、简单染色法：是只用一种染色剂对细胞进行染色。此法操作简便，适用于菌体的一般形态观察，但通常不能显示细胞构造，也不能鉴别细菌类别。染色前必须将菌体涂布于载玻片上并进行固定，其目的是杀死细菌，并使菌体粘附在载玻片上，防止菌体被染色剂冲掉。此外还可增加菌体对染料的亲和力。 （2）、革兰氏染色实验原理 3、革兰氏染色法(Gram stdn)是丹麦医生Gram于1884年创立的。通过这一染色，可把几乎所有细菌分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(简写为G+、G-)两大类。因此它是细菌分类鉴定时的重要指标。又由于这两大类细菌在细胞结构、成分、生理、生化、遗传、免疫、生态及药物敏感性方面都呈现出明显的差异，因此任何细菌只要先通过简单的革兰氏染色，即可提供不少其它重要的生物学特征方面的信息。 （3）芽孢染色原理 4、芽孢壁比营养细胞的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色较营养细胞难。采用碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢同时染色后，用蒸馏水冲洗，脱去菌体颜色，保留芽孢的颜色。并用另一种对比鲜明的染料使菌体着色。 三、实验材料及仪器 (一)菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 大肠埃希氏菌(Escherichia coli) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (二)试剂 革兰氏染色液、（草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95％乙醇、番红染色液）、孔雀石绿染液。 (三)其它 显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，香柏油，二甲苯，擦镜纸等。 四、方法与步骤 (一)制备涂片 (1)涂片：取洁净无油载玻片一块，在其中央滴加一小滴无菌水，用接种环以无菌操作法从试管斜面取少许细菌培养物，在载玻片上的水滴中研开后涂成薄的菌膜(直径约1cm)。如是液体标本，直接用接种环挑取1—2环菌液，涂布于玻片上，制成薄的菌膜。 (2)干燥：将涂布的标本在室温中自然干燥。如需加速干燥，可在酒精灯火焰上方的热蒸汽中加温干燥，但切勿在火焰上直接烘烤。 (3)固定：手执玻片一端，涂有菌膜的一面朝上，以其背面迅速通过火焰2—3次，略作加热，以玻片背面触及手背皮肤，以有热感但不觉烫为度。 (二)染色1、革兰氏染色 (1)初染：在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色约1—1.5min，然后用细小的水流从标本上端冲净残余染液(注意勿使水流直接冲洗涂菌处)，至流下的水无色为止。 (2)媒染：滴加路哥氏碘液覆盖菌膜，媒染约1—1.5min，然后用流水冲洗掉多余的碘液。用吸水纸吸干载片上的水分。 (3)脱色：倾斜玻片并衬以白色背景，流滴95％乙醇冲洗涂片，同时轻轻摇动载片使乙醇分布均匀，至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止脱色，并立即用水冲净乙醇。 (4)复染：滴加番红染液，染色1—2min，水洗后用滤纸吸干水分。 革兰氏染色 2、芽孢染色 (1)用培养24h左右的斜面菌种作涂片、干燥、固定、加滤纸。 (2)滴加3—5滴孔雀石绿染液于固定好的涂片上至滤纸饱和。 (3)用试管夹夹住载玻片，在火焰上方徐徐加热，保持染液冒蒸汽而不沸腾，切勿使染液蒸干，必要时应添加少许染液。从染液蒸汽开始计时，加热4—5min。 (4)倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止 (5)用番红水溶液复染1min，水洗。 (6)待干燥后，置油镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色 芽孢染色 五、实验内容 （1）将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别做革兰氏染色。 （2）制备大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，并做革兰氏染色，以进行对比。 （3）制备枯草芽孢杆菌涂片，做芽孢染色。 （二）、光学生物显微镜的使用 一、目的和要求 由于微生物的个体小，必须借助于显微镜将其放大才能看清楚它们的形态，所以显微镜的使用是微生物学的基本操作，必须认真掌握。 1．了解普通生物显微镜的构造和性能 2．正确掌握显微镜的使用技术和保养方法 二、实验材料及仪器 (一)标本片 自己制作的细菌涂片 (二)仪器和药品 普通光学生物显微镜、镜头纸、香柏油、二甲苯等。 四、显微镜的保养 显微镜是精密贵重的仪器，须很好地保养。使用时应注意下列事项。 (1)显微镜不能随便拆卸，各透镜应用镜头纸擦拭不得以手沾抹或用其它纸、布等擦拭，以免破坏镜头，沾上手印。 (2)勿将显微镜与酸、碱及挥发性药品放在一