氯化锂保护大鼠视网膜神经细胞损伤分子机制初步探讨.pdf

氯化锂保护大鼠视网膜神经细胞损伤分|了机制的初步探讨 中文摘要 氯化锂保护大鼠视网膜神经细胞损伤 分子机制的初步探讨 专 业：眼科学 硕士研究生：李凡 导 师：余克明副教授 中文摘要 氯化锂是一种常见的抗抑郁、抗躁狂类药物，近年来其神经保护作用方面的 研究越来越引起人们的重视。已有大量文献报道了该药物在体内和体外的神经保 护作用，但其对视网膜神经节细胞保护作用方面的报道较少。 参与视网膜神经节细胞损伤的因素很多，但最终共同的通路是视网膜神经节 细胞DNA损伤所导致的细胞凋亡。在神经元的DNA损伤中，DNA双链断裂 (DoubleStrand Break，DBS)足DNA损伤的主要形式之一，如果该损伤不能得 到及时修复，将给细胞带来严重的后果，导致细胞凋亡。 因此，从DNA损伤与修复的角度，对氯化锂保护视网膜神经细胞损伤的分 子机制进行初步探讨和分析，对进一步研究氯化锂视神经保护机制有着重要的意 义。 目的： 1．通过体内、体外实验观察并验证氯化锂对视网膜神经细胞的保护作用。 2．观察氯化锂对视网膜神经细胞DNA非同源末端连接修复频率的影响。 IV、Ku、Mrel 3．观察氯化锂对参与DNA非同源末端连接的Ligase 1及转录因 子CREB、CTCFmRNA表达的影响，并对各因子变化原因进行初步探讨。 方法： 氯化锂保护大鼠视网膜神经细胞损伤分子机制的初步探讨 中文摘要 1．原代培养SD乳鼠视网膜神经细胞，MAP2免疫荧光法鉴定神经细胞纯度。 ％FBS的培养基，进行缺血处理，36h后倒置显微镜下进行拍照，比较不同 组问突起长度的差异。 2．原代培养视网膜神经细胞，缺血处理40h后提取细胞总DNA，电泳检测DNA 的完整性。 3．原代培养SD乳鼠视网膜神经细胞，RT-PCR检测氯化锂对MreI l、Ku、Ligase IV表达的影响。 4．Realtime IV， RT-PCR进一步检测氯化锂对原代培养视网膜神经细胞Ligase 转录因子CREB和CTCF表达的影响。 5．通过质粒转染，利用流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例，即视网膜神经细 胞DNA非同源末端连接(NHEJ)的修复效率。 6．动物实验：实验组大鼠每日皮一卜注射I．5mEq／Kg氯化锂，对照组注射等量 PBS，采用前房灌注法制造急性高眼压缺血再灌注损伤大鼠模型，术后l大、 l周、2周取材，制作石蜡切片，进行常规HE染色、DAPI染色和原位凋亡 检测，体内观察氯化锂对视网膜神经细胞的保护作用。 结果： 1．MAP2免疫荧光鉴定，所培养视网膜细胞中，神经细胞占80％。缺血处理36h 后，对照组神经细胞突起较短(22．07士9．909m)，加入不同浓度氯化锂进行 处理的神经细胞突起较长，较对照组长度差异均有统计学意义；尤其加入 起较对照组明显增长、交织呈网状。 2．DNA电泳结果显示氯化锂促进神经细胞DNA的修复，染色体DNA更完整，发 生的断裂较对照组明显减少。浓度1．0mM氯化锂为最佳。 IVmRNA的 3．RT-PCR检测表明，加入1．0mM氯化锂处理的神经细胞中，Ligase 表达，较对照组有明显增加，而Ku和Mrell表达量未见明显改变。 4．Realtime mRNA的表达较对照组明显增加，另外，转录因子CREB和CTCF的表达也有 Ⅱ 氯化锂保护大鼠视网膜神经细胞损伤分予机制的初步探讨