拟态弧菌OmpU抗原模拟表位筛选鉴定及其免疫特性分析.pdfVIP

摘要 水产动物腹水病是由拟态弧菌(所6r面朋砌记螂，‰)引起的危害严重的细菌性 疾病【l蚓。目前控制该病的主要手段是抗菌治疗，但是随着抗生素的长期使用， 细菌产生耐药性，导致抗菌疗效不明显。因此，研制新型疫苗免疫防治腹水病是 一个亟待解决的问题，而寻找保护性抗原表位是生产新型疫苗的基础17培】。拟态 membrane 弧菌外膜蛋白U(Outer proteinU，OmpU)是一种具有良好抗原性和 高度保守性的黏附素蛋白【9。1们，可作为首选疫苗候选分子，但其有效保护性抗原 表位至今尚不明确。本研究以纯化的兔抗重组OmpUa多克隆抗体为靶标，应用 噬菌体肽库技术筛选和鉴定出拟态弧菌OmpU蛋白的7个免疫优势模拟表位，并 分析了模拟抗原表位的免疫原性和免疫保护性，研究结果为进一步研制黏附素表 位疫苗奠定了基础。 为了获取用于筛选拟态弧菌ompu蛋白的B细胞模拟表位的分子靶标，采用 饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法提纯兔抗重组OmpUa多克隆抗体。纯化的 mg／mL，ELISA效价高达 兔抗重组0mpUa抗体的纯度达到95％，浓度为1．5 1：4096000，完全可用于后续的噬菌体随机肽库筛选试验。 为了筛选鉴定OmpU蛋白的B细胞模拟表位，用纯化的兔抗重组OmpUa 抗体为筛选靶标，对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗筛选。经过3轮淘洗后， 噬菌体的投入产出比呈上升趋势，噬菌体得到较好富集。随机挑选68个噬菌体 克隆，经双夹心ELISA和竞争ELISA鉴定出9个阳性噬菌体克隆。提取阳性噬 菌体克隆单链DNA进行序列测定与分析，结果显示9个克隆共呈递 HDSSKFPYVPSY、FNLHAWPTLDT、HA 7个12肽序列，它 们与0mpU蛋白均无3个以上连续的相同氨基酸残基，说明它们是模拟表位。 B细胞表位的关键氨基酸。 使用筛选鉴定的7个噬菌体阳性克隆作为抗原分7组免疫昆明小鼠，每组 10只，同时做噬菌体原始肽库阴性对照和拟态弧菌灭活菌体阳性对照。免疫程 序为：腹腔免疫，免疫剂量为1012PFU噬菌体／只，首免后14天二免，二免后lO 天三免，免疫途径和剂量均同首免。第3次免疫后7天测定出各组免疫小鼠血清 攻毒试验结果显示，各组免疫小鼠分别获得了70％(7／10，C2l克隆)、80％(8／10， C20和C25克隆)和loo％(1 而噬菌体M13对照组的小鼠全部死亡。说明7个携带ompu蛋白B细胞模拟表 位的噬菌体克隆均具有良好的免疫原性和免疫保护性，C17、c24、c60和C66 阳性噬菌体克隆所呈递的模拟表位可作为疫苗侯选表位。 综上所述，本研究利用噬菌体随机肽库技术首次筛选鉴定了拟态弧菌OmpU 蛋白的7个保护性模拟表位，其研究成果拥有自主知识产权，也为设计安全有 效的黏附素表位疫苗奠定了坚实的基础。 关键词：拟态弧菌，外膜蛋白u，B细胞模拟表位，噬菌体随机肽库技术， 免疫保护性 lI Abstract The ascitesfluiddiseasein animalsisaserious diseasecaused aquatic important Vibrio by mimicus．Antibioticsare usedas thedisease． commonlycontrolling resistanceof HoweVer，antibioticbacteriaiscaused bylong-timeusingantibiotics， whichleadtobadantimicrobial isan for n．eatIllen