犬源益生芽孢杆菌筛选及其对攻毒幼犬的保护作用.pdf

四川农业大学硕士论文 中文摘要 微生态制剂作为生物兽药和饲料添加剂已广泛用于治疗和预防仔猪、犊牛、 羔羊、家禽等动物肠炎、腹泻病。但是犬用微生态制剂研究应用较少，目前专门 用于宠物犬的国产微生态制剂还没有问世。开发犬用微生态制剂，不仅对生态养 犬有重要意义，而且给生物兽药业和饲料工业带来巨大的经济效益。而要开发高 质量的微生态制剂，菌种的选择是关键。因此，本研究从不同品种宠物犬的粪样 中分离和纯化出可作为犬用微生态制剂的备用菌株，并对筛选出的菌株从安全性、 分子生物学鉴定和对攻毒幼犬的保护作用等方面进行了系统评价，其主要内容和 结果如下： 1、用营养琼脂平板从不同品种宠物犬的粪样中分离、筛选出13株芽孢杆菌， 经耐酸和耐胆盐试验初筛到5株抗酸性强和胆盐耐受力强的芽孢杆菌。采用双层 琼脂平板法，用5株芽孢杆菌对5株常见的条件性病原微生物进行抑菌实验，筛选 到芽孢杆菌Y。。具有较好的抑菌效果。药敏实验表明，芽孢杆菌Y。。对常见的7种抗 生素敏感，可作为犬用微生态制剂的备用菌株。 2、采用固体发酵法制备芽孢杆菌Y．。菌粉，以浓度梯度为109 cfu／g、108cfu／g 和107 cf-u／g的浓度添加于饲料中，对40只昆明系小白鼠进行慢性攻毒实验。方差 分析得出各处理组和对照组小鼠体重、免疫器官指数、血液生化指标、盲肠优势 菌群数量和结肠短链脂肪酸含量差异不显著，表明芽孢杆菌Y。。对小白鼠是安全的， 无毒副作用。 3、利用分子生物学技术，从16SrDNA序列同源性和系统发育角度鉴定芽孢 杆菌YIo为Bacillus licheniformis。 4、选取健康幼龄犬16只，研究了同粮中添加芽孢杆菌Y．。对攻毒幼犬腹泻的 影响，并且应用PCR．DGGE技术分析实验不同阶段幼犬肠道菌群结构及多样性。 攻毒实验结果显示：未饲喂芽孢杆菌Y．。的试验组4中犬都出现了腹泻，饲喂了芽 孢杆菌Y。。的试验组3只有一只出现了腹泻现象，说明芽孢杆菌能显著降低幼犬的 谱条带相似性指数都在56％以上(试验组中的一个体除外)。多样性分析显示图谱 条带组内和各组间都没有显著性差异(伶O．05)，实验用的仔犬肠道菌群组成相对稳 定。②实验第9天各处理组肠道菌群组间相似性在58％以上。阳性对照组组内个 体图谱间相似性指数在69％--95％，阴性对照组组内个体图谱间相似性指数为 58％71％。各处理组的多样性从平均11条上升到14条，阳性对照组3个重复的 四j1I农业大学硕十论文 平均条带数为14．7，阴性对照组的3个重复的平均条代数为12，7，说明饲喂芽孢 杆菌能够提高犬肠道微生物的多态性。试验组3攻毒后的平均条带数为13．3，间 于阳性和阴性对照组，表明饲喂芽孢杆菌后，当幼犬受到外源微生物时侵染时， 机体肠道内微生物多态性降低。试验组4攻毒后发生了腹泻现象，平均条带数为 16．6，高于其他各处理组，表明当幼犬受到外源微生物感染时，其机体肠道内菌 群失调，大量微生物被排出了体外。 综上所述，安全性实验评估和对攻毒幼犬的保护作用的检测结果均表明犬源 益生芽孢杆菌Y。。(Bacillus licheniformis)可作为开发犬用微生态制剂的备用菌株， 为犬源微生态制剂的发展提供了可行的备用菌种。而且，犬源益生芽孢杆菌Y．。能 较显著改善犬肠道环境，促进微生态平衡，从而降低腹泻率，为预防犬肠道细菌 性疾病提供了新的思路。 关键词： 芽孢杆菌，筛选，安全性评估，分子鉴定，PCR-DGGE，犬 四川农业大学硕士论文 the ofcanine—orientedBacillusand effecttoE．coli Screening protective andSalmonellainduceddiarrhea Liu Veterinary