应用RNAi技术抑制猪圆环病毒2型复制和表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白杆状病毒免疫的保护作用.pdf

王海燕；应用鼢毗技术抑制猪圆环病毒2型的复制和表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白 i 的杆状病毒的免疫保护作用 应用l矾Ai技术抑制猪圆环病毒2型的复制和表 达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组杆状病毒的免 疫保护作用 研究生：王海燕 导师：高崧教授 刘秀梵教授 摘 要 猪圆环病毒(porcille DNA病毒。分为l型(porcineciI∞vin塔t)rpe cir∞vns咖e 猪的多种病症，如断奶仔猪多系统衰竭综合征(post．we锄jIlg de珊嘶tisand waStiIlgsynd均nle，PMwS)、猪皮炎与肾病综合征(porcirlc nepllropa：t11y 生PMWS以来，现在全世界大多数养猪国家均有该病发生。PCV2感染能造 成免疫抑制，易继发或并发其它病原体感染，对养猪业造成很大的经济损失。 因此，寻找一些新的方法防制该病已成为一项紧迫任务。对该病的防制，一 方面在于研制新型疫苗，如DNA疫苗和亚单位苗；另一方面，一些新技术 的应用，如RNA干扰(时叮A 来发展起来的一种新技术，可通过对特定基因转录出的删[斟A进行降解， 对病原体的复制产生抑制，从而防止疾病的发生。本研究首先从临床上疑为 列进行了遗传分析，获得了基因组的变异信息。对一株PCv2参考毒株的开 扬州大学博士论文 的重组杆状病毒，对其表达的C印蛋白进行了免疫生物学特性研究，同时进 行了杆状病毒表达的C印蛋白对小鼠的免疫保护试验。对测定的和网上登录 的PCV基因组序列进行了同源性分析，应用相关软件和网上资源设计了6 si鼢蛆表达质粒，鉴定出了相应的插入序列正确的克隆，对PCVl和PCV2 毒株在Duk细胞及PCV2毒株在小鼠体内复制的抑制作用进行了初步研 究。 1．江苏部分地区lO株猪圆环病毒2型分离株的分子流行病学 不同分支上，遗传上有一定差异，但总体上遗传关系较近，基因组同源性在 98．3．99．5％之间，同处于PCV2基因1群中。 其中一株分离自家养野猪的 PCV2和其它7株遗传关系非常近，可能是同一个起源。这些分离株的卿 基因变异程度不大，可作为亚单位苗或DNA疫苗的良好候选基因。 2．表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组杆状病毒对小鼠的免疫 保护作用 通过PCR方法扩增出PCV2 载体，测序验证后亚克隆到转座载体pFastBac蹦1，经再次测序验证后将含 病毒的滴度达到5x10‘p叫n11，以105 SDS．P：AGE和W色Stem kDa，与天然 blot证实C印蛋白已表达，分子量约28 衣壳蛋白分子量大小一致。SDS．PAGE证实，PCV2 Cap蛋白非分泌性、可 试验，能与猪抗PCV2高免血清发生特异性反应，显示重组核衣壳蛋白具有 iii 王海燕：应用RNAi技术抑制猪圆环病毒2型的复制和表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白 的杆状病毒的免疫保护作用 良好的抗原性。重组杆状病毒免疫小鼠，应用间接免疫荧光方法对接种后7d、 从接种后21d开始小鼠血清产生了针对PCV2Cap蛋白的特异性抗体，攻毒 贝数，结果发现表达PCV2 C印的重组杆状病毒免疫后对病毒在小鼠体内的 复制具有一定的抑制作用。 制作用 在对PcV2基因组进行分析的基础上设计了siI矾A片段，合成后构建了 表达载体。 其它物种同源性高的siI矾A片段剔除。结合已