β-琼胶酶AgaB催化活性的定向进化.pdf

高技术通讯2008年2月第18卷第2期 p．琼胶酶AgaB催化活性的定向进化① 马怡茗②路新枝石 超马翠萍 于文功③ (中国海洋大学医药学院 青岛266003) 摘要用体外定向进化技术提高了p琼胶酶AsaS热稳定突变酶M446的催化活性。 采用易错PCR和化学诱变法相结合的方法，构建了M446的突变体文库；利用琼胶酶降解 琼胶在平板上产生水解圈的特性，建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得到酶 活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶Mll7，其酶活提高为突变酶M446的3倍。测 序分析发现编码突变酶Mll7的DNA序列中有4处点突变，其中2处为同义突变，另外2 处引发氨基酸替换，分别为R9K和1111V。对突变酶M117与M446的动力学常数进行了 比较，发现M117的Km值降低了93．4％，Kcat／Km值提高了15倍，由此可以推断突变酶 M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高。 关键词定向进化，易错PCR，化学诱变，酶活力，p琼胶酶 但是Ag招的热稳定性较差。在前期研究工作中我 0 引言 的稳定性比AgaS提高了17．4倍，但同时酶比活力 琼胶是来源于红藻细胞壁的黏性多糖，是目前 降低为野生型的80％。 世界上用途最广的三大海藻胶之一，主要成分为琼 因此，本研究采用易错PCR和化学诱变法相结 合的方法，构建了M446的突变体文库，通过平板水 脂糖。琼脂糖是由(1—3)．O—p．D一半乳吡喃糖残基和 (1—4)一O一3，6一内醚．a．L-半乳吡喃糖残基交替组成的解圈法进行高通量筛选，以期得到耐热性不发生改 线形链状分子。琼胶酶是能够特异性降解琼脂糖的 变而酶活性明显提高的突变体。 水解酶，根据作用机制的不同可以划分为两类：a．琼 胶酶和p琼胶酶…。目前已经发现的琼胶酶绝大多 1 材料与方法 数为B．琼胶酶。根据Henrissat在1991年提出的糖 水解酶的分类方法，已知的琼胶酶被划分在GH一16、 1．1材料 1．1．1菌株与质粒材料 GH．50和GH．86三个家族。8．琼胶酶降解琼脂糖的 DI-ISct和E．coli 产物为新琼寡糖，迄今已报道的隆琼胶酶水解琼脂 大肠杆菌E．coli B121(DE3)； 糖的最终产物主要为新琼二糖、四糖或少量六糖。 sp． 随着琼胶寡糖生理活性的发现，琼胶酶在食品、化妆 品、医药工业及基础研究领域显示出重要的应用价 值[2|。 1．1．2酶和化学试剂 本实验室从一株海洋假别单胞菌CY24中克隆 各种限制性内切酶、DNA聚合酶和T4DNA连 接酶购自大连宝生物(TaKaRa)公司，甲基磺酸乙酯 得到一种新型|3．琼胶酶AgaB[3J，序列分析显示它和 methane 所有已知糖苷水解酶的同源性都很低。AgaB水解(Ethyl 琼胶的主产物为新琼八糖和新琼十糖，不同于已报 于蛋白质层析分离的填料G25，DEAE FF，Phenyl船， 道的琼胶酶HJ。结构上的新颖性和功能上的特异性 Superdex75以及用于蛋白电泳的丙烯酰胺、N，N’一 决定了它在工业和医药方面拥有潜在的应用价值，