藠头凝集素蛋白的分离纯化、克隆表达及抗肿瘤机制的研究.pdf

IMIM(illlllllllllllllUllllllUllllI 2 摘要 Y232551 凝集素是一类具有一个或多个可与单糖或寡糖可逆特异性结合 的非催化结构域的蛋白质，在动物、植物和微生物中广泛存在。植 物凝集素在病原菌防御、细胞识别、细胞生长控制、胞内物质运输 等多种生理生化现象中具有重要作用。本文以传统的药食两用葱属 植物——菖头(Alliumchinense)为材料，通过分离纯化得到一种菖 chinense 头凝集素(Allium lectin，ACL)蛋白，并进行了鉴定、克 隆和重组表达及抗肿瘤活性研究。 7．3)对研磨的新鲜菖头鳞茎进行抽 采用磷酸缓冲液(PBS，pH 提，饱和硫酸铵沉淀法进行粗分离，然后经QSepharose强阴离子交 200葡聚糖凝胶色谱分离得到SDS．PAGE单一条 换色谱和Superdex 带蛋白，质谱鉴定结果显示该蛋白可能为一种甘露糖结合凝集素。 血凝活性研究表明ACL对兔血红细胞凝集活性高，热稳定性较好， 在极端酸性环境中较稳定，且仅有甘露糖对ACL的凝集作用具有抑 制效果。 链eDNA为模板，根据已知葱属植物凝集素基因保守区序列设计引 物，PCR扩增获得约320 bp片段，参照hiTAIL．PCR方法扩增其侧 翼序列，根据所得3’端和5’端序列设计特异引物，PCR获得该基因 ORF序列，共456 bp，编码151个氨基酸。根据核苷酸序列推导氨 基酸序列，可知ACL中包含3个已知的甘露糖结合位点QDNY，进 一步验证ACL为甘露糖特异性结合凝集素。利用BLAST对核苷酸 和氨基酸序列分别进行同源性比对分析，结果显示，该基因与其它 凝集素核苷酸序列同源性介于76％．91％，氨基酸序列同源性在 47％．89％。本研究构建了大肠杆菌重组表达质粒pET28a．ACL并转 化Ecob 纯化融合蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体，为深入研究ACL与肿瘤 细胞的相互作用机制提供了基础。 天然和重组ACL分别作用于人肝癌细胞(Hep．3B)和人脐带静 Tracker AlexaFluor488和Mito 现明显“梯状’’条带。经DAPI、tubulin Red CMVRos分别对细胞进行免疫荧光染色后在激光共聚焦显微镜 发生了变化：细胞皱缩成圆形，细胞核呈现多形化，微管蛋白凝聚 导致细胞骨架破坏，线粒体跨膜电位出现崩解。而native．ACL处理 HUVEC细胞和未处理的阴性对照组细胞形态、细胞骨架等都没有明 显差异。同时，利用anti．ACL一抗和荧光染料偶联的二抗对 native．ACL在细胞中的定位进行，结果表明在ACL处理后的细胞胞 浆中荧光明显，说明native．ACL能与细胞发生作用并进入细胞内。 Western C都出现了表达上调。上述结果表明， caspase．3、Bax、cytochrome 在实验浓度下native．ACL能诱导肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞没有 显著影响。 关键词：菖头；凝集素；分离纯化；血细胞凝集；抗肿瘤活性；基 因克隆 Abstract Lectinsare which oneor more glycoproteinshaving that monosaccharideor reversiblesite