4-1BB%2f4-1BBL双向信号在免疫调节中的作用及其分子机制.pdf

§：!旦昼丝：!旦旦L塑囱篮曼焦复痤翊茔生篮侄厦缝甚盐王担I剑 虫窑擅鏊 4—1BB／4—1BBL双向信号在免疫调节中的作用 及其分子机制 中文摘要 要抗原复合物提供的第一信号(TCR信号)和共刺激分子提供的第二信号(共刺激 信号)。普遍的观点认为共刺激分子的配体和受体结合后，由受体传递共刺激信号(正 向信号)。然而，新近的研究发现共刺激分子不仅可以通过受体传递“正向信号”，而 且同时可以通过其配体传递“逆向信号”。越来越多的研究证实，受体与配体之间信息 刺激分子受体与配体之间的界限变得模糊，同时也意味着共刺激分子介导的免疫过程 比我们了解的更为复杂。 等。在存在TCR信号的条件下，4-IBB共刺激信号可协同CD28的共刺激信号，维 持T细胞的活化状态，抑制活化有道的凋亡(AICD)的发生。CD28共刺激信号主 要在T细胞活化的前期起作用，促进T细胞的增殖并维持其短期的存活，而4-1BB 子，属TNF超家族成员，表达于各种活化的抗原提呈细胞(APC)表面，如IFN．Y 活化的巨噬细胞、CD40配体活化的B细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、T细胞 等。新近的研究表明，细胞膜表面的4-IBBL分子是可以传递逆向信号的功能性分子。 例如，通过膜4-1BBL传递的逆向信号可以抑制活化T细胞增殖并诱导其调亡。 其生存等。4-IBBL传递的逆向信号还能刺激CD34+造血干细胞来源的DC成熟等。 因此，4—1BBL博．1BB介导双向信号在T淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞(DC) 』：!旦旦盟：!旦垦L巫回篮墨在星毽强卫主盟佳围丛2l佥王盟l劁 虫塞撞噩 介导的免疫调节中发挥重要的作用。但这种4．1BB／4．1BBL双向信号在免疫应答和免 疫调节中的作用和确切机理尚待深入研究和全面理解。本研究首先克隆了人全长 4-1BBL分子，建立了4—1BBL转基因细胞，并以此为免疫原，成功研制了两株具有不 同抗原识别位点及功能的抗人4—1BBL单克隆抗体。在上述基础上还探讨了 信号在单核细胞分化发育中的作用及涉及的分子。进而，提出了4-1BB／4—1BBL双向 信号介导免疫应答中单核细胞、Dc和T细胞之间相互作用的新的模型假说。 一、人4-1BBL分子的克隆、基因转染细胞的构建及其单克隆抗体的研制 1人4-IBBL基因的克隆和逆转录病毒表达载体的构建 细胞中克隆了全长4-1BBL基因，通过基因克隆技术，将其插入逆转录病毒载体 pEGZ．Term。进一步通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装 因细胞生长良好，4-1BBL的表达稳定在95％以上。 2鼠抗人4-1BBL单克隆抗体的研制 以L929／4．1BBL细胞作为免疫原，免疫Balb／c小鼠。采用B淋巴瘤杂交瘤技术， 将免疫小鼠的脾脏和小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行融合，经HAT筛选后，以FACS分 析筛选阳性克隆，经过3次亚克隆及反复筛选，最终得到两株持续分泌抗人4-1BBL 单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3Ell和2C7)，经快速定性试纸分析，结果显示，McAb 3El 1和McAb 2C7的Ig类别均为IgGl。经体外长期培养和液氮冻存，复苏的杂交 瘤细胞生长良好，稳定分泌抗体。采用本室建立的腹水诱生和纯化方案诱生腹水， 3E11，2C7腹水型单抗的效价1：1000。3Ell和2C7腹水经ProteinG亲和层析分离纯 化，浓度为0．9。1．2rn。g／ml。纯化后抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为O．25-2．0 “∥1X100细胞。 3鼠抗人4-1BBL单克隆抗体生物学特性的研究 为了研究McAb3Ell和McAb2C7对4-1BBL分子表达细胞的识别和结合特性， II 生!璺旦盟：!壁垒L塾回篮生延星痤遁茔生盟侄出丝甚岔王丑劁 生塞缝要 及流式细胞仪(FCM)分析，结果显示，McAb3El1和McAb 2C7能特异性地识别 3Ell和2C7的抗原识别位点。实验结果表明，McAb3Ell和McAb