兔富血小板血浆的影响骨髓基质细胞生物活性的实验及研究.pdf

兔富血小板血浆影响骨髓基质细胞生物活性的实验研究 中山大学硕士论文 兔富血小板血浆影响骨髓基质细胞 生物活性的实验研究 研究生：吴莺 导 师：凌均柴教授 专 业： 口腔临床医学 摘 要 目的：本研究拟在体外将兔富血小板血浆(platelet—richplasma，PRP)作用于自 marrowstromal 体骨髓基质细胞(bone 物活性的影响，探讨PRP运用于牙周组织再生的可行性，为牙周组织工程学研 究提供实验依据。 材料和方法：①密度梯度离心法分离兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行原代培养， 细胞达80％融合时传代，倒置显微镜下进行形态学观察。②取第3代BMSCs用 SABC法进行CDl46的免疫组化染色，进行细胞来源鉴定。用成骨、成脂诱导 剂对BMSCs进行多向诱导，VonKossa及油红O染色验证其多向分化能力。③ 采用二次离心法分离兔全血获得PRP，人工计数法比较全血与PI冲中血小板数 目。PRP经激活剂(10％氯化钙溶液+牛凝血酶)激活，兔ELISA试剂盒检测上 Kossa染色检测钙化结节。 设矿化诱导组和完全DMEM培养基组。3w后Von ⑥PRP复合BMSCs接种于自体牙骨质片及骨片上培养，扫描电镜分别观察1、 兔寓血小扳血浆影响骨髓基质细胞生物活十牛的实验研究 中山大学硕士沦文 2w的细胞生长情况，培养3w的牙骨质片及骨片经石蜡包埋、切片，HE染色观 察细胞贴附及生氏情况，免疫组织化学染色检测牙骨质片及骨片表面骨钙素的表 达。 结果：①原代BMSCs大约3d可形成多数细胞克隆，细胞呈短梭形，至5--7d 左右可达到80％融合，细胞形态为均一的长梭形，呈漩涡状排列，传代后细胞 形态比原代更均一，生长旺盛，增殖迅速，随传代次数增多，细胞形态出现多样 性，7—8代后逐渐呈老化现象。②用SABC法进行CDl46的免疫组化染色呈阳 性，可证实其为间充质来源的细胞。用成骨、成脂诱导剂对其进行多向诱导后， VonKossa及油红O染色阳性，验证其多向分化能力。③采用二次离心法得到的 PRP中血小板数目是全血的4．4倍。PRP经激活剂激活后，析出的上清液经兔 ELISA试剂盒榆测含有TGF．Bl，在标准曲线上能获得相应的浓度值。④随着PRP 浓度的升高，对细胞增殖呈促进作用，达20％浓度时最高。20％浓度的PRP在 有血清培养基中对细胞增殖的作用大于无血清培养基。⑤PRP作用于BMSCs第 7d，PRP组与完全DMEM培养基组的碱性磷酸酶浓度无明显差异，但矿化诱导 组的碱性磷酸酶浓度则明显高于前两组，差异有统计学意义(P0．01)：第14d， PRP组、矿化诱导组的碱性磷酸酶浓度均高于完全DMEM培养基组，差异有统 Kossa染色阳性。⑥接种于自体牙骨质 计学意义(JpO．01)。PRP作用3w后Von 片及骨片上的BMSCs经含PRP的培养基培养后1w，扫捕电镜观察两者表面均 有大量细胞贴附，相比较而言，牙骨质片上的细胞较骨片上的稀疏；牙骨质片卜 贴附的细胞形态更均匀一致，呈长梭形，而骨片上的细胞呈多角形和梭形。2w 后的牙骨质片和骨片表面可见多少不一的钙盐沉积。培养3w的牙骨质片及骨片 经石蜡包埋、切片，HE染色可见表面细胞贴附，免疫组织化学染色发现表面均 表达BGP。 结论：①经密度梯度离心法分离的兔BMSCs来源于f叫充质，具有多分化潜能。 ②采用二次离心法获得的PI冲具有一定浓度的TGF—B1。③PRP能够促进BMSCs 的增殖，其最适刺激浓度为20％，其增殖作用的发挥不受培养基中血清的影响 并与之有协同促进作用。④PRP对BMSCs的成骨分化有促进作用，提示PRP含 有的细胞因子TGF．61在此过程中起到重要作用。⑤PRP复合BMSCs能够在自 体牙骨质片和骨片上附着并生长，随着培养时问的延长，能够分化为成骨细胞。 兔富血小板血浆影响骨髓基质细胞生物活性的实验研究 中山大学硕士ti塞 关