幽门螺杆菌可塑区jhp947基因功能的初步及研究.pdf

幽门螺杆菌可塑区jhp947基因功能初步研究 中文摘要 背景与目的： 幽门螺杆菌(Yelicobacterpylori，Hp)是定植于胃粘膜表面的革兰氏阴性、 生长缓慢的螺旋状微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子，并且与 胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关。Hp的致病性已得到公认， 但其致病的机制及感染结局的多样性的本质仍未阐明。近年来，人们丌始将寻找 Hp致病特异基因的目标投向其“可塑区”。jhp947基因是位于J99可塑区上的 基因，国外文献报告jhp947基因是Hp的一种新的致病因子，与胃癌、消化性 溃疡等疾病关系密切。因此，本研究通过比较jhp947基因缺失突变株及其相应 野生株J99菌株的主要毒力活性差异及其对宿主细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子 947基因相关的生物学作用及其在细胞水平 的影响，初步评价与Hp可塑区jhp 的毒性以及对细胞因子IL-8、IL一12分泌的影响，为揭示jhp947基因参与Hp 致病过程的分子机制，探索其与消化性溃疡、胃癌的相关性提供实验依据。 方法： l、jhp947基因缺失突变株J99—947△的主要毒力活性检测。 酶活性差异。 1．2采用0．3％半固体琼脂穿刺法比较突变株与标准株的移行能力差别。 1．3采用体外细胞(GES-1细胞)粘附实验检测突变株与标准株的粘附作用差异。 1．4突变株和标准株培养上清以不同滴度作用于GES-1细胞，镜下观察细胞空泡 样变，并结合中性红摄入法定量检测各组空泡毒素活性。 2、J99-947a对GES-1细胞增殖与凋亡的影响。 2．1标准株、突变株分别与GES-1细胞共培养48h，倒置显微镜下观察细胞形态 学变化。 2．2 性的影响。 2．3流式细胞仪检测标准株、突变株与GES-I细胞共培养24h的细胞凋亡情况。 3、J99—947△对细胞因子IL一8、IL—12分泌的影响。 3．1标准株、突变株分别与AGS细胞共培养24h后，收集上清测定IL一8。 3．2从正常人外周血中分离培养鉴定树突状细胞。 3．3标准株、突变株分别与未成熟树突状细胞共培养48h后，收集上清测定IL一12。 3．4标准株、突变株分别与THP一1单核细胞共培养24h后，收集上清测定IL—12。 结果： 1、jhp947基因缺失突变株J99—947△的主要毒力活性。 1．1尿素酶活性标准株组和突变株组在细菌与尿素酶试剂作用后，即刻会引起 明显的颜色变化，两组均在20min即分解完全尿素酶试剂达到最大吸光度值，两 组在5-30min4个时点的吸光度值均无明显差异(pO．05)，提示jhp947基因 缺失对Hp尿素酶活性没有影响。 1．2Hp移行能力在0．3％半固体布氏平板上培养3d后，标准株从穿刺位点处向 周围区域扩散开(平均直径10．3士1．0ram)，突变株形成菌落集群平均直径(9．5 士1．3ram)，二者差异无统计学意义(p0．05)，提示jhp947基因缺失对Hp移 行能力没有影响。 1．3 后细胞周围粘附的细菌数分别为65±18、58±15，两者之间差异无统计学意义 (P0．05)，提示jhp947基因缺失对J99对细胞的粘附能力没有影响。 形成的特点相近。进一步结合中性红摄入法定量评价空泡毒素活性，结果发现， 947基因敲除突变株与其亲本野生株的空泡毒素活性没有明显差别，提示947基 因敲除并不影响VacA活性。 2、J99—947△对胃上皮细胞株GES-I细胞增殖和凋亡的影响。 2．1幽门螺杆菌标准株组J99对GES．1细胞具有损伤作用，随着作用时间的延 长。GES．1细胞形态由贴壁的梭形变为圆形，细胞核染色质浓缩，呈新月形聚集 于核缘，细胞质浓缩，可见空泡变性，死亡细胞逐渐增多。突变株组细胞也出现 2 与标准株组类似的细胞形态学变化。 2．2 细胞的促增殖作用最为明显，具有统计学意义(p0．05)。而标准株组与突变株 组组之间差别无显著性(pO．05)。 2．3流式细胞分析显示，在攻击细胞，标准株和突变株均可引起细胞凋亡，凋亡 别无统计学意义。 3、J99—947a对细胞因子IL-8、IL-12分泌的影响。 两实验组差别无统计学意义(pO．05)。 3．2本实验成功地从正常人外周血中诱导、扩增获得大量imDCs和mDCs，并从 形态结构、表面分子表达及功能状态三方面加以综合鉴定。 而突变株组致树突状细胞分泌IL-12水平