双向电泳操作步骤及相关试剂配制.docVIP

双向电泳操作步骤及相关试剂配制 A． 实验过程 一、实验原理： 2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 二、实验步骤： 1.样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300μl裂解液(1mg蛋白:100μl裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70μl，—80℃保存。 2.Bradford法测蛋白含量 取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。 取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的BSA溶解液，另2管中分别加入2μl的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80μl），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如： 编号 蛋白量（ul） Buffer(ul)Bradford(ml) OD595值 1 0 4 0 2 5 4 0.024 3 10 4 0.061 4 15 4 0.091 5 20 4 0.116 Bt4 2 78 4 0.079 Bt4 4 76 4 转Bt4 2 78 4 0.075 转Bt4 4 76 4 标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。a、b通过作图输入数据可知 相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得 OD值测量过程： 比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。 3.双向电泳第一向IEF（双向电泳中一律使用超纯水） 3.1 水化液的制备 称取2.0mg 的DTT，用700μl水化液储液溶解后,加入8μl 0.05% 的溴酚兰，3.5μl（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。 在含300μg 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340μl，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。 3.2 点样，上胶 分两次吸取样品，每次170μl,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。 3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20℃） S1 (30v,12hr,360vhs,step) S2 (500v,1hr,500vhs,step) S3 (1000v,1hr,1000vhs,step) S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad) S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时 其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦。 3.4 平衡 用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。 平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。 4.双向电泳第二向SDS 4.1 配胶(两根胶条所用剂量) 分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED 30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml 分离胶buffer 20ml 10%APS 220μl TEMED 44μl 双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8%