分子生物学实用技术实验操作教程.docVIP

实验一 CTAB法提取植物基因组总DNA及分析 一、实验目的 分离纯化植物DNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术要求，CTAB法是提取植物基因组DNA的一种新型方法，可以抽提许多其它方法难以抽提的植物材料（如含多酚较多的植物材料、干燥后的茶叶、老树根等）中的DNA，得率高，质量好，用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。 二、基本原理 植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。采用CTAB（十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提液抽提（65℃）上述研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质（沉淀相）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质。直接向水相中加入异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀、TE溶解得到DNA粗提物。粗提的DNA一般可用于粗略PCR等。 用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。用RNase水解RNA，用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。 三、实验材料 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)幼叶。 四、主要仪器设备及耗材 Eppendorf 5804R低温离心机，Hettich Universal 32R低温离心机，Eppendorf Minispin离心机，Sanyo SIM-F124制冰机，TOMY SS-325自动灭菌锅，Millipore Elix纯水系统，Eppendorf research微量移液器系列，GingTian JA2003A电子天平，Satorius PB-10 pH计，HH·S21-4-S恒温水浴锅，UVP GDS8000自动高效紫外透视成像仪，DYY-8C型双稳电泳仪Gene spec I快速核酸蛋白自动分析仪，长岭BCD-239家用冰箱，TNZ-30-50液氮生物容器及液氮，微波炉，研钵，离心管（15ml、1.5ml），枪头（10、200和1000μl），两面板，枪头盒，离心管盒（1.5ml）等。 五、主要试剂 1、CTAB抽提液： 2%（w/v）CTAB 100mmol/L Tris-HCl（pH=8.0） 20mmol/L EDTA（pH=8.0） 1.4mol/L NaCl 最后pH值8.0。 抽提含多酚较多的植物材料时，上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。 抽提液于室温保存，可在几年内保持稳定。临用之前向装有上述抽提液的试管中加入终浓度为2%-3%（v/v）的β-巯基乙醇。 醋酸钠溶液：3mol/L NaAc，用冰乙酸调pH值至5.2。 TE溶液： 100mmol/L Tris-HCl 1.00mmol/L EDTA 最后pH值8.0 。 其它：无水乙醇，异丙醇，75％乙醇，酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），氯仿/异戊醇（24：1），β-巯基乙醇，重蒸水，单蒸水，RNase A(10μg/μl)，琼脂糖，6×上样缓冲液，λHindIII DNA marker，EB溶液（0.25μg/ml），1×TAE缓冲液。 六、实验步骤 （一）、DNA的粗提 向15ml离心管中预先加入5ml CTAB抽提液及0.1ml的β-巯基乙醇，混匀，65℃预热； 1.00g幼叶用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入该15ml离心管中，盖严后迅速摇匀； 于65℃水浴45min，中途间隔轻柔颠倒混匀3-4次； 冷却后加入等体积(5ml)氯仿/异戊醇，轻柔颠倒混匀使乳化10min； 10000rpm室温离心10min； 吸取上清于另一干净的15ml离心管中； 加入与上清液等体积（约5ml）的异丙醇，颠倒混匀，约1至2分钟后应有白色絮状沉淀出现； （若没有，则加入上清液1/5至1/10体积即0.5-1.0ml的醋酸钠溶液，混匀至形成沉淀团）； 用尖头剪大的1.5ml枪头吸住沉淀团，移入盛有1ml 75%乙醇的1.5ml离心管中。若无法直接吸取，则于4℃、1000rpm离心3min收集沉淀DNA； 在75%乙醇中漂洗沉淀DNA数分钟以上，用枪头吸干乙醇； 用0.5ml 75%乙醇再漂洗2次； 无水乙醇漂洗1次； 沉淀于室温或37℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明，不要过度干燥； 用500μl TE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗提物可用于粗略PCR等。 （二）、DNA的纯化 向TE溶解的DNA粗提物中加入4-10μl RNase A(约40-100μg)，轻柔混匀； 于65℃酶解RNA 30min以上； 加入500μl酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒