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共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究 中文摘要 共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究 中文摘要 一、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞的分离培养 目的：探索人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells ， hBMSCs ）与人软骨细胞（human Articular Chontrocytes ，hACs ）的体外分离及培养过 程，并对其进行鉴定；尝试利用转化因子 β1 （Transforming growth factorβ1，TGF-β1） 诱导 hBMSCs 向软骨细胞分化。 方法：取 5～8 岁儿童四肢长骨骨折需髓内钉固定者，抽吸其钻孔后流出的骨髓， 通过分离、离心获得细胞，采用低糖 DMEM 培养基进行体外培养，采取流式细胞仪 对培养的细胞进行鉴定；使用倒置显微镜观测细胞形态及生长状况，绘制 hBMSCs 生长曲线。利用 TGF-β1 诱导 hBMSCs 向软骨细胞分化。对诱导后的细胞进行阿利新 蓝染色、蕃红花-亮绿染色检测细胞蛋白聚糖﹙Aggrecan ，GAG ），免疫组织化学染色 检测 II 型胶原。 取多指（趾）患儿切除下来的关节软骨，分离、消化获得软骨细胞，鉴定同 hBMSCs 诱导软骨细胞。 结果：hBMSCs 呈现贴壁生长，约 2ml 骨髓中获得的 hBMSCs 经 10 天左右可长 满六孔板的一孔。传代后，其第一代～第五代生长旺盛，培养至二十代渐出现凋亡。 第三代 hBMSCs 经流式细胞仪检测 CD34、CD45 表达阴性，CD29 表达阳性。利用 TGF-β1 诱导后的 hBMSCs 其阿利新蓝、蕃红花-亮绿及免疫组化 II 型胶原染色表达 阳性。 多指（趾）软骨细胞 2 周长满六孔板的一孔。鉴定结果同 hBMSCs 诱导软骨 细胞。 结论：1、在体外成功分离、培养了hBMSCs 和 hACs 。 2 、hBMSCs 可来源于 5～8 岁儿童四肢长骨骨髓。 3 、成功利用转化因子 β1 诱导 hBMSCs 分化成软骨细胞。 I 中文摘要 共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究 二、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共混培养体外构建组织工程软骨 目的：研究 hACs 与 hBMSCs 直接接触共培养的最佳比例；比较混合培养与 TGF-β1 诱导 hBMSCs 体外构建组织工程软骨的效果。 方法：取上述分离培养后第三代 hBMSCs 和第三代 hACs 以 2 ：1、1：1、1：2 的比例共培养并接种于丝素蛋白支架（实验组A 、B 、C ）。同时建立诱导剂诱导第三 代 hBMSCs 向软骨细胞分化并接种于丝素支架的对照组D ；建立单纯第三代 hACs 接 种于丝素支架的对照组 E 。保持各组细胞总数一致。将细胞-支架复合物进行体外培 养 3 周，采用倒置显微镜、大体形态、组织学 HE 染色、II 型胶原染色、阿利新蓝比 色法测 GAG 含量及 Hoechst33258 荧光法行 DNA 定量分析进行观察。 结果：各组细胞在丝素蛋白三维支架上均生长良好；各组细胞支架复合物外观大 小无明显差异。A 组（hBMSCs ：hACs=2 ：1）与 D 组（TGF-β1 诱导组）形成的细 胞支架复合物弹性、光泽较差，组织学染色见细胞增殖少，细胞外基质分泌水平较低， GAG 与 DNA 定量分析结果低于其他三组。C 组（hBMSCs ：hACs=1 ：2 ）构建的细 胞支架复合物具有最佳的弹性与光泽，组织学染色见细胞支架结合紧密，细胞增殖较 多，胞外基质丰富，GAG 与 DNA 定量分析结果最高。B 组（hBMSCs ：hACs=1 ：1） 与 E 组（单纯 hACs 组）体外构建的组织工程软骨质量相当。 结论：1、hBMSCs 与 hACs 之间的相互作用有利于软骨细胞外基质的产生，比 例为 2 ：1 时即可获得与 TGF-β1 诱导 hBMSCs 相当的成软骨效应。 2 、hBMSCs 与 hACs 直接接触共培养比例为 1：2 时具有最佳的成软骨 效应