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蔗糖酶 Km值的测定 酶活力预试 底物浓度与酶促反应速度 结果处理 思 考 题 Km值的含义及测定的方法 * 实验原理 酶促反应速度在实验中反映为：单位时间内产物浓度的增加量或单位时间内底物浓度的减少量 酶促反应的速度要在酶促反应进行的初期进行测定，即测定酶促反应的初速度 酶促反应初速度与底物浓度的关系用米氏方程来表示： V0 ──── Vmax [S] Km + [S] V0：酶促反应初速度 Vmax：最大反应速度 [S]：底物浓度 Km：米氏常数 Km值等于酶促反应初速度为最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的基本的特征常数之一，它包含着酶与底物结合和解离的性质，特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时。 不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同 Km值可近似地反映酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大 大多数纯酶的Km值在0.01～100 mmol/L Lineweaver-Burk Kinetics （双倒数作图法） * + 1 Km 1 1 V0 Vmax [S] Vmax 选择不同的[S]，通过测定产物量来计算V0，直线做图，即可得出Vmax和Km值 y a x + b 以对照管调零点，于520nm处测OD值（1.0-1.8） 1.1 1.1 H2O 2.5 2.5 0.1M NaOH溶液 0.5 0.5 二硝基水杨酸试剂 0.1 酶（用水比例稀释 对照管（n 管） 测定管（n 管） 管号 试剂 ml 混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 25℃水浴5min 0.1 酶（用水比例稀释） 25℃水浴3min 0.2 0.2 pH5.0醋酸缓冲液 0.6 0.6 300mM 蔗糖溶液 酶沉淀溶于10ml蒸馏水，10,000rpm离心10min, 取上清 （目的：找到酶最佳稀释比例） 注意该浓度用量即为酶促反应测定的最大用量 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 pH5.0醋酸缓冲液 1.10 1.30 1.50 1.60 1.62 1.64 1.66 1.80 H2O 稀释后的酶液 25℃水浴 5分钟 2.5ml 0.1M的NaOH 0 0 25℃水浴 3分钟 0.5ml DNS溶液 0.60 0.40 0.20 0.10 0.08 0.06 0.04 300mM蔗糖溶液 7 6 5 4 3 2 1 管号 试剂ml 混匀，沸水5min，流水冷却3min， 以 “0”管调零，520nm测OD值 标准曲线用上次课做过的数值，也可再做一次 1/v 1/[S] [S] mM v [葡萄糖产量×10] mg/ml 葡萄糖产量 mg OD520 7 6 5 4 3 2 1 管号 结果 v: 生成产物葡萄糖的速率（5min单位时间内, 1ml酶液反应生成的葡萄糖的量）； [S]: 底物蔗糖的摩尔浓度； 300：本实验用蔗糖溶液的浓度 300mM； V： 各试管中加入的底物蔗糖的体积ml； 2： 反应的总体积是2ml； 1000：将反应的总体积换算为L 300×V 2 预习 温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响 需自行设计实验方案！！！ * * * 在酶促反应进行的初期，产物浓度的增加量与时间成正比，酶促反应速度保持恒定；随时间的延长，由于反应产物增加而对反应的抑制（酶促反应是可逆的）、底物浓度的降低以及酶本身可能的活性下降等原因，酶促反应速度随反应时间的延长而逐渐下降。 因此酶促反应的速度要在酶促反应进行的初期进行测定，这样才能反映出作为催化剂的酶在催化反应时的真实状况。 米式方程反映的是已知Km及Vmax时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。