《第1章 细胞培养基本知识技术》.ppt

第一节 实验室设置 第二节 建立细胞培养实验室的设备器材 第三节 清洗、包装、清毒 第四节 培养用液 第五节 其他培养用液 第六节 基本培养方法 第一节 实验室设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏 。 （一）无菌操作区 无菌操作区是只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离．不能穿行或受其他干扰。无菌操作室应划分为更衣间、缓冲间、传递仓及操作间三部分。 1 更衣间：供更换衣服、鞋子及穿就帽子和口罩。 2 缓冲间：缓冲间位于更衣间与操作间之间，目 的是为了保证操作间的无菌环境。同 时可放置恒温培养箱及某些必须的小 型仪器（如冰箱、离心机等）。 3 无菌操作间 ：专用于无菌操作、细胞培养。 （二）孵育区 （三）制备区 制备区主要进行培养液及有关培养用液体等的制备。在有天平、PH计、磁力搅拌器等设备下完成制备以后。应在无菌操作下进行过滤除菌。液体制备直接关系组织细胞培养的成败，因此必须严格无菌操作。 （四）储藏区 储藏区的要求是取放方便，主要有冰箱、干燥箱、液氮罐、细胞培养液、培养瓶等、此环境也需要清洁、无灰尘。 （五）清洗和消毒灭菌区 清洗和消毒灭菌区应与其它区分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等的工作。 第二节 建立细胞培养实验室的设备器材 一 大型仪器 净化工作台 CO2培养箱 倒置显微镜 二 消毒灭菌类 三 配液用具 四 制备细胞用品 超洁净工作台（生物安全柜） （二）注意事项： 1、净化台宜安置在清洁房间（无菌室）内，防止尘土阻塞滤器，缩短高效滤器使用寿命，降低净化效果。 2、必须经常注意工作区上方微压表的指示。一旦感到气流变弱，如酒精灯火焰不动，加大电机电压也不见情况改变则说明滤器已被阻塞、应及时更换。一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过滤布拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔3—6个月进行—次。根据净化台周围环境的洁净程度，定期(2～3个月)将粗涤纶滤布清洗或更换。 3、新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 4、定期(一般1周)对环境迸行清扫和灭菌工作。经常用沾有酒精或丙酮等有机溶剂的纱布擦拭紫外线杀菌灯表面，保持其表面清洁，否则影响杀菌效果。 5、每次使用工作台时，应先用75％酒精擦洗台面，并提前以30一50min紫外线灭菌灯。在关闭灭菌灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。 6、净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。 7、每次使用净化台后要及时清除工作台面上的物品，并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。 CO2培养箱 多数的细胞培养实验室已使用CO2孵箱。其优点是恒定的提供所需要的一定量的CO2(常用为5％CO2)，使培养液的pH保持稳定，适用于开放或半开放培养。培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶；由于这种培养方法培养器皿内部与外界相通。因此培养箱内空气必须保持清洁，定期以紫外线灯或酒精擦拭消毒。同时尚需保持箱内的相对湿度为l00％，防止培养液蒸发，箱内要放置内为无菌蒸馏水的水槽。 CO2培养箱是培养细胞的专用设备. CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的三个条件. 稳定的温度. 大于95%的相对湿度. 稳定的CO2浓度 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来的新品种,它可同时控制O2浓度. 注意事项 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证通气。但瓶口过松，易污染。 2 保持CO2培养箱内空气干净。定期用紫外线灯消毒，或用酒精纱布擦拭后，再用无菌干纱布擦干。 3 箱内水槽中加 1／3— l／2体的灭菌蒸馏水（1000毫升蒸馏水中加新洁尔灭5毫升），以维持箱内湿度，避免培养液蒸发。 4 取放培养物时，可将培养瓶皿置于带盖搪瓷盘或饭盒内，缩短开箱的时间，减少CO2消耗。搪瓷盘入箱前，盘外壁要先用酒精纱布擦拭，再用无菌干纱布擦干，以减少微生物带入箱内。 一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮度)发生变