猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存技术的研究.pdfVIP

猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存技术的研究1 戴建军, 芮荣, 武彩红，葛立军，卢庆 南京农业大学动物医学院，江苏南京(210095) E-mail ：rrui@ 摘 要：不同冷冻保护剂(EFS40, EDS 和ES)对猪GV 期卵母细胞的毒性试验表明，以ES 液 组合作为玻璃化冷冻液，毒性作用最低，与对照组间无明显差异（P0.05 ）。用ES 液组合 作为玻璃化冷冻液，以3 种冷冻载体分别用于猪GV 期卵母细胞冷冻保存，结果发现，OPS 法冷冻猪GV 期卵母细胞，所获冻后存活率明显高于电镜铜网法和细管法（65.4%对45.0% 和 38.6% ，P0.05 ），并可获得最佳的冻后成熟率（43.3% ）。猪GV 期卵母细胞单纯经细胞 松弛素 B 和离心极化处理，不至于严重影响卵母细胞的存活，但卵裂率要显著低于对照组 （39.0%对52.1% ，P0.05 ）；若经细胞松弛素B 处理或细胞松弛素B ＋离心极化处理，再进 行玻璃化冷冻，并未提高卵母细胞的冻后存活率与发育率；采用 OPS 法直接进行GV 期卵 母细胞的玻璃化冷冻，获得7.8 ％的冻后卵裂率，并获得桑椹胚发育。 关键词：猪；卵母细胞；玻璃化冷冻 猪卵母细胞体积大、脂质含量高，冷冻保存的难度较大。自Rall和Fahy[1]首次报道小鼠 胚胎的玻璃化冷冻保存以来，玻璃化冷冻技术受到广泛的关注。该技术因冷冻时间短，操作 简便，并且不需要特殊的设备，而愈来愈受到人们的青睐。猪卵母细胞内的脂质含量约为绵 羊的 1.8 倍、牛的 2.4 倍和小鼠的 6.8 倍[2] 。长期以来，由于猪卵母细胞的这一结构特点，使 其对低温极其敏感[3]，致使相关研究一直未获得突破性进展。有关猪卵母细胞冷冻保存的大 多数报道，仍局限于冻后形态与发育上，冷冻效率依然偏低。因此，研究和改进猪卵母细胞 的冷冻方法，依然是一项重要的任务。本实验试图从冷冻保护剂、冷冻载体和冷冻处理等方 面，探讨提高猪卵母细胞冷冻保存效率的可能途径，以期完善猪卵母细胞冷冻保存技术，提 高其冻后发育能力，为建立有效的猪卵母细胞冷冻保存技术平台奠定基础。 1 材料与方法 1.1 猪 GV 期卵母细胞的采集 从南京市哈慈天环食品有限公司下属屠宰场采集猪卵巢，置于 37 ℃、含青霉素和链霉 素各 500 IU/mL 的生理盐水中，2 h 内送达实验室。以抽吸法采集卵巢表面直径2~5 mm 卵 泡卵母细胞，在实体显微镜下选择胞质均匀、包被 3 层及 3 层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细 胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs ）作为供试GV 期卵母细胞，用 TCM199 液洗 2~3 次后备用。 1.2 玻璃化冷冻液的配制 1.2.1 ED/EDS 液和 EG/ES 液的配制 乙二醇（EG ）、二甲亚砜（DMSO ）和含 10% NCS （新生牛血清，杭州四季青生物工程 1本课题得到上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字【2003】第14－1号）和国家自然科学基金 的资助。 -1- 材料有限公司）TCM199 （GIBCO BRL ）三者按体积比 1:1:8 充分混匀，即为 ED 液；将 0.6 mol/L 蔗糖溶于体积比按 1:1:3 充分混匀的 EG 、DMSO 和 TCM199 （含10% NCS）混合液 中，即为EDS 液。将 EG 和 TCM-199 液按体积比 1:4 充分混合后，为 20% EG 溶液；将 0.5 mol/L 蔗糖溶于按体积比 2:3 混合的 EG 和 TCM-199 溶液中，即为 ES 液。以上液体经过滤、 分装，于 4 ℃保存备用。 1.2.2 EFS20 和 EFS40 溶液的配制 30%聚蔗糖（Ficoll-70 ）和0.5 mol/L 蔗糖溶于含 10% NCS TCM199 溶液中，充分混匀 即为FS 液，再将 EG 和 FS 液按体积比 2:8