Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4的表达及单克隆抗体的研制.pdf

II 型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4 的表达及其单克隆抗体的研制 中文摘要 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4 的表达及其 单克隆抗体的研制 中文摘要 目的：II 型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Proteases ，TTSPs ） 是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的丝氨酸蛋白酶，在哺乳动物的许多生 物学过程中扮演着重要角色，其功能异常可导致癌症、缺铁性贫血、耳聋、心血管疾 病等。在人类，TTSPs 共有17 个成员，其中人呼吸道胰蛋白酶样蛋白酶（Human airway trypsin-like protease，HAT ）最早发现存在于慢性呼吸道疾病患者的痰液中，在粘液 生成、水解流感病毒的血凝素抗原以及细胞迁移和基底膜的降解中起到关键性的作 用。HATL4 蛋白酶为TTSPs 中HAT/DESC 亚家族中的一个成员，目前国内外尚未见 有关HATL4 蛋白酶生物学功能的任何报道，对它的生物学活性和功能知之甚少。本 研究首先探讨HATL4 在人恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中的表达；然后 表达、纯化重组HATL4 ，免疫小鼠，研制抗人HATL4 单克隆抗体；并运用蛋白质免 疫印迹法、流式细胞术等实验方法对所制备的抗体进行验证，为进一步研究 HATL4 的生物学功能提供工具。 方法： （1）利用反转录PCR （RT-PCR ）技术检测HATL4 在人恶性血液病细胞系和白 血病患者骨髓细胞中的表达； （2 ）利用RT-PCR 从人成巨核细胞白血病细胞系MEG-01 中扩增编码HATL4 蛋 白的蛋白酶活性区域片段，与克隆载体pMD18-T simple 连接，经Sac I、Hind III 双 酶切鉴定后送测序，然后定向插入原核表达载体pQE30 ，并在原核表达菌株M15 中 实现重组蛋白6His-HATL4 的表达； （3 ）利用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白，并对纯化产物复性和浓缩；用Western blotting 分析纯化产物； （4 ）以纯化的HATL4 融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c 小鼠，采用B 淋巴细胞 杂交技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0 进行融合。采用 ELISA 方法，用纯化的重组HATL4 融合蛋白筛选只与HATL4 反应的能持续分泌抗 I 中文摘要 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4 的表达及其单克隆抗体的研制 人 HATL4 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过 Protein-G 亲和层析柱纯化腹水， SDS分析纯化结果。 （5 ）HATL4 真核表达载体的构建：采用RT-PCR 技术从人成巨核细胞白血病细 胞系（MEG-01 ）中扩增HATL4 基因 cDNA 全长基因片段，经过酶切鉴定后，克隆 至pcDNATM3.1/V5-HisTOPO TA 载体，测序鉴定。 （6 ）HATL4 在CHO 细胞的表达：根据Fermentas 转染试剂说明书，将HATL4 真核表达载体转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO ），用蛋白质免疫印迹法检测重组蛋白 的表达。 （7 ）HATL4 抗体的鉴定：流式细胞术及免疫荧光等实验方法对所制备的抗体进 行鉴定。 结果： （1）采用RT-PCR 技术对 18 种人恶性血液病细胞系和81 例恶性血液病患者骨 髓细胞中HATL4 mRNA 的表达进行分析，发现HATL4 mRNA 在急性髓细胞白血病 （Acute Myelocytic Leukemia ，AML ）患者骨髓细胞中表达特异性增高。 （2 ）构建了HATL4 原核表达质粒，并在M15 中成功表达HATL4 融合蛋白； SDS显示该融合蛋白分子量约26 kDa，与预期结果相符；融合蛋白以包涵体形 式存在，表达产量约占菌体总蛋白60% ；经纯化、复性后的融合蛋白纯度95% ，Western blotting 结果显示一条his 抗体特异性识别的蛋白条带。 （3 ）成功获得分泌稳定的单克隆