微生物降解菲的研究学年论文.doc

学年论文 姓名：韩向豪 学号学院：应用化学学院 专业：化学 班级：0901班 2011-4-17 微生物降解菲的研究 韩向豪 孙鹏飞 摘要 微生物降解是环境中菲去除的重要途径。为有效开展菲污染的微生物学治理, 采用室内模拟的方法,从菲污染土壤中分离到一株高效降解菌株, 研究了其最适产分解菲的条件。结果表明,菲的非生物解吸大致可分为快速、慢速和极慢速解吸3个阶段. 在慢速解吸阶段, 生物条件下沉积相菲浓度降低速率是其非生物解吸速率的1.9 - 4.0倍, 微生物加速了菲从沉积物中的释放过程。微生物的活性影响沉积物中吸附态菲的微生物可利用性，在降解后期通过向体系添加微生物和营养盐， 在保持微生物活性的条件下，生物降解时菲的固相残留值远小于非生物解吸条件下菲的固相残留值，吸附态菲的平均生物降解速率约为其解吸速率的1.2倍,且沉积物中与黑炭结合的菲也能部分被微生物利用。 关键词：菲； 微生物降解； 解附 前言 菲作为一类典型多环芳烃, 在环境中含量正持续增加, 对生态健康已构成严重威胁[1]。近年来研究表明, 微生物降解作用是环境中菲分解与转化的重要途径, 利用微生物治理菲的污染是一种有效方法, 已显示出良好的应用前景[2]。微生物降解有机物的本质是酶促降解。作者从被菲长期污染的水源中分离到一株优势菌, 主要研究了该菌株产酶条件和酶的基本性质,找出了菲降解的条件。在生物降解一定时间后向体系中添加具有高度活性的微生物和营养盐, 确保降解后期微生物的活性, 以研究微生物对降解菲的为基础，从而为开展对菲污染的酶学控制提供了科学的理论依据。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 超净工作台、高低速离心机、摇床和超声波细胞破碎机等仪器, 试剂均为A.R.级。本研究中所用试剂包括菲(固体) (分析纯, 北京化学试剂公司)、甲醇(色谱纯, 德国Merck 公司)、正己烷(色谱纯, 天津市化学试剂有限公司)、XAD-2树脂( Amberlite公司) . 菲的标准样品购自中 国国家标准样品中心. 菲的储备液为在长江水中添加分析纯固体菲, 浓度为0. 4~ 0. 6mg\L-1 2.3 菲降解菌的分离、富集与降解效率实验 向配置的标准营养液样品中加入固体菲样品,分别在不同的温度下培养30d后采用平板划线的方法在以菲为唯一碳源和能源的无机盐固体培养基上划线分离, 并且培养1周, 得到以菲为唯一碳源和能源进行生长的菲降解菌株. 将分离得到的菲降解菌株重复上述过程进行纯化3~ 4次, 持续3~ 4个月, 直到无机盐培养基中为单一菌种为止. 在降解试验开始前将上述纯化后的菌株放入牛肉膏液体培养基中扩增2d, 3000r min- 1离心30min, 富集至磷酸盐缓冲溶液中备用.经过16s·r-1扩增及序列测定, 该分离纯化后的细菌为Agrobacterium.无机盐培养基配方: 2.2g N a2HPO4、0.8g KH2PO4、3.0g NH4 NO3、0.2g M gSO4·7H2 O、10mg FeSO4·7H2 O、10mg CaCl2·2H2 O、10mL 矿物溶液、1000mL H2O, pH = 7. 2~ 7. 4。其中矿物溶液的组成:50mg ZnSO4·7H2 O、50mg MnSO4·5H2 O、10mgNa2MoO4·2H2O、5mg CuSO4·5H2O、100mL H2O. 牛肉膏液体培养基配方:牛肉膏3. 2g, 氯化钠5. 0g，蒸馏水1000mL, pH = 7. 2~ 7. 4。磷酸盐缓冲溶液: pH =7. 0 的Na2HPO4·12H2O和NaH2 PO4·2H2O混合液。为了研究微生物的降解效率, 在未加颗粒物时向菲的储备液中加入菌悬液, 一定时间后取样,1500r· min- 1离心15min, 上清液用液相色谱测定菲的浓度, 绘制微生物降解菲的效率曲线。 2. 4 固相吸附态菲的微生物降解和非生物解吸模拟试验 在100mL 锥形瓶中加入0. 2g 沉积物和50mL菲的储备液. 放入恒温振荡培养箱, 温度为24℃, 转速为130r·min- 1。2d后, 弃去锥形瓶体系的上清液,加入50mL经过灭菌处理的长江水和2mL菌悬液,通过比色法确定菌悬液中细菌数量, 保证各瓶中微生物数量约等于107个. 将锥形瓶封口, 置于恒温振荡培养箱中( 24℃, 130r·in- 1 )培养, 每隔一定时间取3个平行样. 用液相色谱分别测定水相和颗粒相菲的浓度, 以绘制吸附态菲的微生物降解曲线, 即体系菲浓度随时间的变化曲线; 并计算污染物的降解速率, 以单位时间污染物质量浓度的变化幅度来表示, 单位为g·g- 1同时将样品高温灭菌后