全长A型肉毒毒素突变体构建及其在产气荚膜梭菌系统中表达和研究.pdfVIP

  摘 要 肉毒神经毒素 (botulinum neurotoxin, BoNT) 是一种大分子的毒性蛋白，根据其抗原性的不 同，可分划为A～G 7 种血清型。每型 BoNT 均由一条单一多肽链组成，分子量约为 150KDa， 在结构上分为两部分：轻链（Lc ，50kDa ）为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性；重 链（Hc ，100kDa）为结合和转位结构域。由于BoNT 的中毒剂量小，潜伏期短，致死率高，已 成为最具威胁的生物恐怖剂之一。所以，发展 BoNT 疫苗对预防肉毒中毒，以及应对生物恐怖 袭击具有重要的医学意义。 首先，为了评价 BoNT/A Lc 突变体蛋白的活性，我们克隆、表达了 BoNT/A Lc 的作用底 物 SNAP-25 蛋白。将本室保存的 pET22b-SNAP25 质粒转入 E.coli BL21(DE3)感受态细胞中， 25 ℃，120r/min 水浴摇床振荡培养过夜，采用终浓度为 1mM 的IPTG 诱导表达，表达产物经过 SDS电泳分析。结果表明，目的蛋白在上清和包涵体中均有分布，为了保证 SNAP-25 的生物学活性，我们采用了上清中的蛋白来进行下一步的活性分析实验。 其次，利用实验室已构建的含有 BoNT/A Lc 目的基因片段的质粒pET-32a-ALc ，采用定点 突变技术，对 BoNT/A Lc 中Arg362 、Tyr365 和 Glu350 三个关键性的氨基酸位点进行了突变， 获得了 BoNT/A Lc 的突变体。采用低温诱导，表达融合蛋白的方法，成功获得了可溶性的 BoNT/A Lc 及其突变体蛋白。通过该突变体与 BoNT/A 底物蛋白 SNAP-25 的切割反应，发现未 经突变的 BoNT/A Lc 蛋白能够特异性的识别 SNAP-25 上的 Q197-R198 位点，而突变体蛋白则 完全无法识别该位点，不具有金属内肽酶活性，从而证明通过定点突变，我们成功的去除了毒 素的毒力，为下一步的全长 BoNT/A 重组疫苗的研究打下了基础。 最后，为有效表达全长 BoNT/A 大分子抗原，本实验选用了与肉毒梭菌同属的产气荚膜梭 菌(Clostridium perfringens)表达系统。先以肉毒梭菌的 DNA 为模板，通过 PCR 的方法扩增全长 3901bp 的BoNT/A 基因，并克隆至 T 载体得到 pMD18T-BoNT/A 载体，核苷酸序列测定结果表 明，与 GenBank 上所公布的 A 型肉毒梭菌 62A 标准株（登录号：M30196.1 ）序列一致性为 100%。 然后以 pMD18T-BoNT/A 载体为模板，按前述方法进行定点突变（Arg362Ala 、Tyr365Phe 、 Glu350Ala ）, 经测序分析正确后，经 BstBI 、Bsu36I 双酶切将全长 BoNT/A 突变体基因连接到 pJRC200 载体中，再通过电击转化的方法转入低毒产气荚膜梭菌 ATCC3624 细胞中，进行厌氧 培养表达目的蛋白。用 SDS和 Western blot 分析，发现 BoNT/A 突变体蛋白在产气荚膜 梭菌芽孢体中大量表达，而在繁殖体中没有表达，表达出的 BoNT/A 突变体蛋白可以很好的被 抗 BoNT/A 马血清识别，从而为下一步研制重组全长 BoNT/A 口服疫苗的奠定了基础。 关键词：肉毒毒素，突变体，疫苗，产气荚膜梭菌，表达 I   Abstract Botulinum neurotoxin, which is the most toxic substance, is produced by Clostridium botulinum. It consists of seven serotypes that have been assigned the letters A through G according to its antigenicity. Each serotype BoNT is composed by a single polypeptide chain of molecules about 150 KDa, which can b