人促血液血管细胞生成素功能性受体的探索和靶向粘附斑激酶（FAK）的RNA干扰与研究.pdf

中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生论文 第一部分； 人促血液血管细胞生成素的功能性受体nucleolin的鉴别 中文摘要 道的一种对血液血管干细胞有促增殖作用的细胞因子。对HAP0的生物学功能 研究发现，HAPO体外可以促进成人骨髓细胞的增殖。对胎儿骨髓的培养中，我 们发现HAPO可以促进骨髓的造血细胞(悬浮细胞)和基质细胞(贴壁细胞) 的增殖，因而我们推测HAPO主要作用于早期的造血干细胞和内皮细胞。体外 实验中我们还发现HAP0可以通过激活P13K—Akt信号传导途径抑制白血病细 胞系M07e的凋亡。此外，稳定转染}IAPO的小鼠骨髓基质细胞体外具有造血支 持作用。虽然对HAP0的生物学功能和信号通路有了一定的理解，但是HAPO的 受体还未知。 在本研究中，我们在体外实验中发现HAPO可以促进人脐静脉来源的细胞 系EcV304的粘附和迁移，并呈现剂量的依赖性。由于其他已经研究的细胞或者 因为技术上的难度不容易获得或者需要依赖细胞因子生长从而代价昂贵，因此我 我们利用免疫共沉淀的方法发现HAPO组较对照组多了一条110KD的蛋白带， 我们将该条带送到国家生物分析中心进行质谱测序，通过和基因库里的序列比较 发现该蛋白是核仁蛋白(nucleolin)。由于核仁蛋白是主要表达于核内的蛋白质， 所以我们首先检测了核仁蛋白在Ecv304细胞膜上的表达。我们分别利用流式细 胞术、提取膜蛋白的方法检测蛋白的表达，最终我们发现核仁蛋白确实表达在 EcV304细胞的细胞膜上，这与已经报道的文献吻合。进一步实验中，我们利用 蛋白质overlay的方法检测到在物理水平上HAPO与核仁蛋白确实可以互相结 合。活细胞共定位实验进一步证明了HAP0在活细胞的水平上也可以与核仁蛋 白相结合。为了证明核仁蛋白是HAP0的功能性受体，我们利用核仁蛋白的抗 体进行了阻断实验，发现在有100倍摩尔浓度的核仁蛋白抗体存在的情况下， HAPO对EcV304细胞的促粘附作用受到了抑制，因此可以确定表达在细胞表面 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生论文 的核仁蛋白是HAP0的功能性受体。为了进一步确认这一点，我们构建了 胞HEK293中，转染后16小时，利用流式细胞术的方法检测细胞表面的核仁蛋 白的表达，我们发现16小时后293细胞表面确实表达了核仁蛋白。我们利用转 染后的细胞进行迁移实验，发现与未转染细胞以及转染对照质粒的细胞相比， HAPO大大促进转染细胞的迁移。这些结果进一步说明了核仁蛋白是HAPO的 功能性受体。 总之，我们鉴定了核仁蛋白是HAPO的功能性受体，并发现它与HAPO的 一些生物学功能相关，这值得我们进行进一步的研究以加深对HAP0生物学功 能和作用机制的理解。 关键词：人促血液血管细胞生成素，核仁蛋白，Ecv304，粘附，受体，造血， 血管新生 2 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生论文 Identi们ca悄onofnucIeo¨nasa functlonaI of receptOr hemangiopoietin《HAPO) Abstract descr_bedas for a factorthe Hemangiopoietin(HAPO)isfirstly gro、f1，th ceIIsofbOth and Our primitiVe hematopOietic endotheliaflineageby labO旧toⅣ lnVjvo shOwed HAPO the