水疱性口炎病毒甲基转移酶功能位点与研究.pdf

摘 要 stomatitis 水疱性口炎病毒(Vesicular 包括加帽、甲基化和聚腺苷酸化。病毒mRNA的甲基化对于mRNA的稳定和病 毒蛋白的翻译十分重要。单节段负链RNA病毒具有独特的mRNA帽甲基化机制。 2’．O (2-0)甲基转移酶催化活性，而这两个甲基转移酶活性位点共用一个甲基供体S． 腺苷甲硫氨酸结合位点。不同于常规的mRNA帽甲基化，水疱性口炎病毒2’．O 甲基化过程先于G-N．7位点甲基化，且对后者有促进作用。为了完成甲基化， RNA底物必须与甲基转移酶结合。 生物信息学分析显示水疱性口炎病毒L蛋白第VI功能域一些高度保守的氨 基酸残基可能具有对RNA底物识别的功能。通过水疱性口炎病毒反向遗传系统， 应用基因定点突变对预测的RNA底物结合位点进行检测。发现对氨基酸残基位 的甲基化。 通过对Y1650和F1691两个氨基酸位点用不同芳香氨基酸进行替换突变研 究，结果表明并没有影响甲基转移酶活性，显示芳香氨基酸对于RNA结合和进 一步的甲基化的重要性。而VSV MTase上E1674不可替换，该位点分别以天冬 氨酸(D，相同极性)，谷氨酰胺(Q，相同尺寸)和赖氨酸(K改换极性)进行突变替 换，结果表明，均明显消减G-N．7和2-O甲基化。 下基因和生物化学上的佐证： 两个mRNA甲基转移酶使用同一个RNA结合位 点，同时，RNA底物的识别需要底物与甲基转移酶上的芳香氨基酸相结合。 VSV-F1691A甲基化能力致弱。通过蚀斑试验和成长复制特性分析，发现这些重 组病毒在细胞毒性上致弱。通过口腔灌服途径将106PFU的重组病毒接种5周龄 强的致病性。免疫后的小鼠用野生型水疱性口炎病毒(vsv)进行攻毒，发现 仅对动物的致病性减弱，而且表现出良好的免疫原性。因此，甲基化酶致弱的水 疱性口炎病毒可能成为有良好开发前景的活疫苗。 关键词：水疱性口炎病毒；甲基转移酶；体外转录；RNA修饰；疫苗 2 Abstract Vesicular stomatitis and virusⅣSV)synthesizescapped,methylated ofviral is mRNAessentialfor polyadenylatedmessengerRNA(mRNA)．Methylation rnRNA andviral stability protein translation．Non-segmented RNA a viruses mechanismformRNA vesicular possessunique capmethylation．For stomatitis VIinthe virus(vsv)，conservedregion large(L)polymeraseprotein both ribose2’·O catalyzes guanine-N一7(G-N一7)and thetwo activitiessharea site methylase forthe donor