乙醛酸循环在马尔尼菲青霉致病机制中的作用与研究.pdf

乙醛酸循环在马尔尼菲青霉致病机制中的作用研究 乙醛酸循环在马尔尼菲青霉致病机制中的作用研究 专业：分子医学 博士生：孙九峰 导师：席丽艳教授 中文摘要 马内菲青霉病是由马内菲青霉感染引起的一种严重的深部真菌病，主要流行 于东南亚地区，该病与HIV／AIDS的流行有高度相关性。由于马内菲青霉病的传 染源和传播途径不明，发病隐匿，病死率高，着力于马内菲青霉流行病学及发病 机制等研究已刻不容缓。马尔尼菲青霉是已知的青霉菌属中唯一温度依赖的双相 型条件致病真菌，在25℃以菌丝相生长，侵入人体后即转变为致病的酵母相。 在机体内，马尔尼菲青霉被巨噬细胞吞噬后，能够在巨噬细胞内生存，当机体免 疫功能下降时，可在巨噬细胞内繁殖并引起播散而发病。关于马尔尼菲青霉可能 的致病基因、蛋白及与宿主的相互作用机制已成为阐明该疾病发病机制研究的核 心。已有的研究多集中在马尔尼菲青霉的极化生长、双相转换的分子机制以及与 宿主巨噬细胞问的粘附、抵抗巨噬细胞内氧化、硝基化反应的机理，然而未能就 马尔尼菲青霉如何在巨噬细胞内维持生存的机理进行深入的探讨。 不同于其它通过逃避吞噬而致病的病原菌，马尔尼菲青霉属于胞内寄生真 菌，其在宿主巨噬细胞内维持生存的能力被认为是该菌引起感染的关键。宿主巨 噬细胞内是一个葡萄糖，氨基酸等营养缺乏的微环境，在此种微环境下，微生物 无法利用三羧酸循环进行物质和能量代谢，而是利用微环境中的低营养碳源(二 碳)成分作为营养来源进行糖异生，合成糖原及重要的中间代谢产物，为微生物 提供生存必需的生物大分子和能量，进而在巨噬细胞内不利的微环境中生存下 来。乙醛酸循环能够同化脂肪酸氧化产生的或是基质本身含有的二碳成分，经糖 异生合成糖及重要的中间代谢物，为微生物提供生存必需的生物大分子和能量。 该循环是一些细菌、真菌及植物所特有的代谢途径，与糖酵解、糖异生及三羧酸 循环等代谢途径构成微生物的基础代谢网络。通过对巨噬细胞内白念珠菌的13 乙醛酸循环在马尔尼菲青霉致病机制中的作用研究 氧化、乙醛酸循环、糖异生及糖酵解等代谢途径研究，发现调节D氧化、乙醛酸 循环、糖异生等代谢途径的各个关键酶基因转录水平均明显上调，而糖酵解的关 键酶则呈下调趋势，显示了碳源从脂肪酸向葡萄糖方向的流动。通过对结核分支 杆菌中乙醛酸循环的作用研究，亦发现乙醛酸循环不仅调节巨噬细胞内结核分支 杆菌利用碳源，而且是巨噬细胞内结核分支杆菌的重要致病因素。前期，我们通 过马尔尼菲青霉菌丝相和酵母相的差异蛋白研究，发现乙醛酸循环的关键酶一异 柠檬酸裂解酶蛋白在酵母相中高表达。在体外马尔尼菲青霉感染巨噬细胞的实验 中，发现在巨噬细胞内的马尔尼菲青霉编码异柠檬酸裂解酶的acuD基因也显著 上调。因而我们推测在巨噬细胞内，马尔尼菲青霉亦可能启动乙醛酸循环而获取 维持生存的主要物质能量。 本课题拟通过建立小分子RNA干扰体系，构建马尔尼菲青霉的异柠檬酸裂 解酶acuD基因小分子RNA干扰株，观察干扰株、野生株在体外利用碳源的能 力是否不同；巨噬细胞感染模型评价干扰株、野生株在巨噬细胞内的生存情况及 刺激巨噬细胞产生细胞因子的能力；裸鼠感染模型评价乙醛酸循环在马尔尼菲青 霉致病性中的作用。 研究目的 利用RNA干扰技术，靶向干扰下调乙醛酸循环关键酶编码基因acuD，以期 阐明乙醛酸循环对马尔尼菲青霉体外生长、细胞内维持生存及体内致病性的影 响，为进一步阐明马尔尼菲青霉病的发病机制提供理论基础。 研究方法 得到靶向GFP基因的RNA干扰质粒。电转化入GFP标记马尔尼菲青霉菌株。通过 荧光量的表达变化反映建立RNA干扰体系效率、稳定性。 体外评价乙醛酸循环对马尔尼菲青霉利用低营养基质的影响：shRNA设计软件 设计合成多条针对acuD的干扰序列，定向克隆入pSilent．1，得到成熟的干扰质 中山大学博士学位论文 乙醛酸循环在马尔尼菲青霉致病机制中的作用研究 霉酵母相。测定阳性克隆在PDA、乙酸盐、TW80、YNB氮源培养基上生长情 况。应用reaitime—I玎．PCR、westernblot、酶活测定法测定乙酸盐培养基上培养 时，异柠檬酸裂解酶表达情况。 体外评价乙醛酸循