磁富集多重PCR扩增技术及应用.pdf

摘 要 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR ）由于其特异性 强、灵敏度高、快速简便等优点，一直是生命科学领域一种重要的研 究手段。增强其特异性，提高其灵敏度，是 PCR 技术研究的重点。 我们制备了平均粒径为 15 nm 的γ-Fe O 磁性纳米粒子，并对其 2 3 进行链霉亲和素修饰。实验证明链霉亲和素修饰的 γ-Fe O 磁性纳米 2 3 粒子具有良好的生物活性，可以进一步用于生物检测。 我们将磁性纳米粒子 γ-Fe O 和多重 PCR 技术相结合，进行了磁 2 3 富集多重 PCR 扩增，以增强其特异性，提高检测灵敏度。 首先我们对该方法的可行性进行分析，进行了磁富集靶序列单重 PCR 扩增。在这一实验过程中，先将生物素修饰的特异性引物和靶序 列杂交，然后通过链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子 γ-Fe O 将其富集 2 3 到表面，通过变性获取单链靶序列，再使用目的序列的扩增引物进行 PCR 扩增。通过对实验条件的优化，我们得到靶序列和特异性引物杂 交的最适温度为 52.5℃，链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子 γ-Fe2O3 的 最佳用量为 90 μg，该方法对靶序列检测的灵敏度为 5×10-10 ng/μL 。 确定了该方法的可行性。 然后我们设计了 AGT 基因 M235T 位点和 A-6G 位点，MTHFR 基因 A1298C 位点和 C677T 位点的扩增引物，在磁富集单重 PCR 的 基础之上，对这四个位点进行磁富集多重 PCR 扩增，并优化了扩增 条件。通过优化实验我们得到，这四个位点的磁富集多重 PCR 的退 火温度为 56℃，在 30 μL 扩增体系中，25 mmol/L 的Mg2+用量为 2.0 μL ，10 μmol/L 的dNTP 用量为 1.5 μL ，5U/μL 的Taq 酶用量为 0.7 μL ， 10 mmol/L 的四个位点引物的用量分别为：C677T 1 μL 、M235T 0.7 μL 、A1298C 1 μL 、A-6G 1.5 μL 。同时得到这四个位点的磁富集多重 PCR 扩增的灵敏度为 5×10-9 ng/μL 。 最后，结合通用引物 PCR 技术和基因芯片技术，对磁富集多重 PCR 扩增方法在这四个位点的 SNP 分型上进行了初步应用研究。 关键词： γ-Fe O ，杂交，优化，磁富集单重PCR ，磁富集多重PCR 2 3 I ABSTRACT Because of the adv