2013-2014学年高中生物 6.2 基因工程及其应用素材 新人教版必修2.docVIP

第六章从杂交育种到基因工程 第2节基因工程及其应用 1．限制性内切酶及其特点 在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害。科学家还注意到，这种酶是从DNA分子内部切断DNA的，因此，这种酶称做限制性内切酶。美国生物学家内森斯和史密斯因发现了限制性内切酶而获得1978年度的诺贝尔生理学或医学奖。 限制性内切酶通常能识别4～6个碱基长度的特定DNA序列，并能以特定的模式剪切DNA链。一般来说，被识别的DNA序列是回文序列。这种序列的特点是，当从左右两端分别阅读这段双链DNA的碱基序列时，双链上的碱基序列是相同的。按照切割的方式，限制性内切酶可以分为错位切和平切两种，它们分别产生黏性末端和平末端。 目前大约已有500种限制性内切酶，这些酶的命名方式与EcoRI一样遵循统一的规则。第一个字母是分离出此酶的细菌属名的第一个字母，后两个字母为种名的前两个字母，小写，株系数字通常都省略，罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出的不同的限制性内切酶。如HpaI和HpaⅡ就是从同一种细菌中分离出来的第一种和第二种内切酶。 几种常用的限制性内切酶及其酶切位点如下表： 几种常用限制性内切酶及其酶切位点 限制性内切酶 识别位点 限制性内切酶 识别位点 EcoRI XbaI XhoI NdeI G↓AATTC T↓CTAGA C↓TCGAG CA↓TATG ApaI BgⅡ ClaI SmaI GGGCC↓C A↓GATCT AT↓CGAT CCC↓GGG 基因工程中的运载体? 在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA（一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对），有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。作为运载体必须具有三个条件：在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。 目的基因的制备? 所谓目的基因就是人们所需要转移或改造的基因。获取目的基因的方法很多，可以归纳为以下几种。鸟枪法? 这种方法类似于鸟枪发射散弹。具体的做法是：用若干个合适的限制酶处理一个DNA分子，将它切成若干个DNA片段。这些片段的长度相当于或略大于一个基因。然后，将这些不同的DNA片段分别与适当的载体结合，形成重组DNA，再将它导入到相应的营养缺陷型细菌中。例如，当我们要提取维生素B1合成酶基因时，就要采用维生素B1的营养缺陷型细菌（它在不含维生素B1的培养基上不能生长）。把整合了不同DNA片段的营养缺陷型细菌分别接种到不含维生素B1的培养基上进行培养，只有那些整合了含有维生素B1合成酶基因的DNA片段的细菌才能正常生长。最后，把这些细菌中的这段DNA分离出来，再进行一系列的操作，就可以获得维生素B1合成酶基因。这种方法的缺点是专一性较差，分离出来的有时并非一个基因，但由于这种方法操作简便，所以现在仍然广泛采用。 反转录法? 这种方法是在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。 根据已知的氨基酸序列合成DNA? 这种方法是建立在DNA序列分析基础上的。当把一个基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按图纸先合成一个个含少量（10～15个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系使它们形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。这种方法专一性最强，现在用计算机自动控制的DNA合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。但是这种方法目前仅限于合成核苷酸对较少的一