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实验二 斜面接种，用平板划线法分离菌种与微生物培养 【课前预习】 微生物纯种分离有哪些方法？ 【目的要求】 1.懂得微生物接种技术的重要性与应用面； 2.正确掌握无菌操作法移接斜面菌种的步骤与方法； 3.了解平板划线法分离菌种的基本原理； 4.熟练掌握平板划线法的操作方法； 5.掌握超净工作台的使用方法。 【基本原理】 一、斜面接种与培养基本原理 　　操作为：用灭菌的接种环取单个菌落或少许细菌，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端。 二、用平板划线法分离菌种基本原理 步骤：用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用于目的微生物的分离。 【实验用品】 1. 菌种： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌斜面培养基。 2. 培养基： 牛肉膏蛋白胨斜面培养基。 3. 仪器： 恒温培养箱，无菌操作台，高压蒸汽灭菌器。 4. 其它用品： 培养皿（每组4个），无菌水，灭菌棉签，接种环(25个)，酒精灯（25盏），试管架，记号笔（25支）。 【方法步骤】 一、斜面接种操作步骤 1.接种前的准备工作 1贴上标签 2旋松棉塞 3点燃酒精灯 2.用接种环转接菌种 1手持试管 2灼烧接种环 　　图1 接种环的火焰灭菌步骤 【方法步骤】 二、平板划线法操作步骤 1.融化培养基：琼脂培养基放入水浴中加热至融化。 2．倒平板 3．划线分区 4．划线操作 【方法步骤】 3拔出棉塞 4管口过火与停留 5取培养物 6接种 7杀灭环上残留菌 3．培养与观察 4．培养物后处理 1清洗 2清理桌面 【方法步骤】 (1) 挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。 (2) 划A区 【方法步骤】 4.恒温培养 5.挑单菌落 6.清洗培养皿 【方法步骤】 实验结果 结果 记录斜面划线接种后生长的培养物特征（菌名、菌苔特征），并图示。 菌苔特征描写方法参考如下： 形态：松针状，树枝状 干湿情况：干燥，湿润，粘稠 高度：扁平，隆起，凹下 　 实验结果 　　透明度：透明度，半透明，不透明 　　颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等 　　边缘：整齐，不整齐 　　接种情况：稀疏、致密、水膜等 【注意事项】 1.接种前，务必核对菌种和菌株名，防止混淆或错接菌种。 2.接种环自菌种管移至待接斜面过程中，切莫接触其他物品，以免斜面接种污染。 3.接种环在接种前需用酒精灯进行灼烧，灼烧后必须等接种环完全冷却后，才能进行接种，以防止所接菌种失活。 4.划线时，环口与平板间的夹角不宜太大，动作要轻巧，以防划破平板。 5.用于划线的平板，在倒平板的时候不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板时，培养基温度不要太高。 【注意事项】 6.分段划线时，在每次划线后，都需将接种环进行灼烧，待冷却后再进行下一次划线。 7.接种前，务必核对菌种和菌株名，防止混淆或错接菌种。 8.接种环自菌种管移至待接斜面过程中，切莫接触其他物品，以免斜面接种污染。 9.接种环在接种前需用酒精灯进行灼烧，灼烧后必须等接种环完全冷却后，才能进行接种，以防止所接菌种失活。 实验思考 （1）接种时可否将棉塞放在桌上？菌种管和待接种新鲜斜面试管可否平放在桌面上？为什么？ （2）为了防止斜面接种时避免杂菌污染，在操作中应注意哪些问题？ （3）用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？有何优点？ （4）要防止平板被划破应采取哪些措施？ （5）为什么在划完A区后要将接种环上的残菌烧掉？划后面几区时是否也要经过同样的处理？ A区 B区 C区 D区