龙须菜高温胁迫响应的钙调素信号传导途径研究.pdf

龙须菜高温胁迫响应的钙调素信号传导途径的研究 摘 要 龙须菜是一种重要的产琼胶海藻，研究龙须菜的高温胁迫分子响应机理对于 提高其高温耐受性，延长栽培期，提高产量具有重要意义。研究表明，钙．钙调 素(Ca2+_CaM)信号传导系统在植物的高温胁迫响应中起重要作用。本论文拟 在前期通过对龙须菜进行高温胁迫下的SSH差异显示得到CaM的表达序列标签 的基础上，首次克隆龙须菜的CaM基因及筛查到的其结合蛋白——肌醇．1．磷酸 合成酶(MIPS)的基因，并研究其在高温胁迫下的表达模式，为探讨龙须菜对 高温胁迫的响应机理打下基础，并为龙须菜耐高温品系的选育提供可用的基因信 息。 本论文首先分别从野生型和981龙须菜中克隆得到多种钙调素(CAM)亚型 的基因组中均为单拷贝。而cam2在两种龙须菜中有所不同，其中野生型龙须菜 cam2 序列均无内含子，基因相似性为78％，其所编码的氨基酸序列的相似性为87％。 cam3 序列长度为447bp，但目前该基因只能从野生型龙须菜基因组DNA中扩增得到， 无法从cDNA中扩增得到，推测cam3可能在转录过程中沉默。 采用荧光定量PCR的方法测定在280C和320C的热激条件下，981和野生 型龙须菜不同CaM亚型的表达情况，发现无论是在280C还是320 C的热激条件 下，caml在981龙须菜中的表达水平在整体上高于野生型龙须菜，表明981龙 须菜的caml在高温胁迫下能更有效表达，以传递热激信号，使得981龙须菜对 高温的耐受能力更强。cam2在981龙须菜中的表达情况与caml不完全一致，在 280 C热激时，cam2的整体表达水平低于caml，但在320C热激条件下，两者 表达情况相似，推测在981龙须菜热胁迫信号的传导过程中，CaMl可能为起主 要作用的CaM亚型，而CaM2只有在981龙须菜处于温度更高、热激时间更长 等更为苛刻条件下时才会上调表达，对CaMl起到有效韵补充和辅助作用。此外， 本实验发现野生型龙须菜的cam2只有通过巢式PCR反应才能够从其高温胁迫表 达的cDNA中扩增出来，而不能通过一步PCR反应直接扩增到目的条带，可能 由于其在cDNA中的拷贝量较低，因此无法利用荧光定量PCR对其热胁迫下的 表达水平进行检测。相比较而言，981龙须菜中可能有更多的CaM参与热激信 号传导，这可能与981龙须菜耐高温性更强直接相关。 据文献报道CaM自身并没有活性，只有活化后进一步与钙调素结合蛋白 (CaMBP)的短肽序列结合，才能诱发其结构变化，从而共同调控信号传导途 径，因此研究CaMBPs有助于探明钙调素介导的信号转导途径。本实验室前期 通过酵母双杂交系统筛查获得了龙须菜CaM结合蛋白——肌醇．1．磷酸合成酶 (myo．inosit01．1-phosphate 致，且与其它物种mips具有较高同源性，其DNA序列全长为2067bp，无内含 子，开放阅读框为1623bp，可编码540个氨基酸。对MIPS氨基酸序列分析，推 CaMBD所具有的结构特征。将该MIPS与CaM进行酵母双杂交回复验证，证 明MIPS与CaM存在相互作用，是龙须菜的一种钙调素结合蛋白。通过Real．Time PCR对32。C热激下981龙须菜和野生型龙须菜CaM与MIPS的表达量进行测 定，发现其表达水平均呈现周期性上升趋势，但CaM与MIPS的表达趋势并非 完全一致，可见MIPS虽然可能是CaM的一种下游结合蛋白，但其表达水平并 未随着CaM的表达水平升高或降低，表明CaM可能不是MIPS唯一的上游激活 物质，两种蛋白都具有独立的活性，共同在龙须菜抵御高温胁迫的过程中发挥作 用。此外，981龙须菜MIPS的表达水平明显高于野生型，这可能与981龙须菜 的耐高温特性直接相关。 关键词：龙须莱；热胁迫；钙调素；肌醇一卜磷酸合成酶；转录分析 ResearchontheCalmodufin UnderHeat SignalingSystem ShockinGracilaria lemaneiformis A