DJ-1稳定高表达对模拟缺血%2f再灌注所致H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用研究.pdf

摘要 摘要 目的： 构建DJ．1真核表达载体，筛选DJ．1稳定高表达的H9c2心肌细胞系：在此 基础上，探讨DJ．1高表达能否对抗模拟缺血再灌注(sI瓜)所诱发的氧化应激 损伤，并进一步探求其可能的机制。 方法： 1．根据大鼠DJ．1基因序列(NM057143．1，CDS298～867)，设计特异性克 (H9c2／DJ．1．A和H9c2／DJ．1．B)，并通过Westernblot测定稳定转染细胞中DJ．1 胞系(H9c2／Sham)作为对照用于后续细胞实验； (sI瓜)。实验处理后，利用MTT法检测各实验组细胞存活率；按试剂盒说明测 blot分别检测 流式细胞术检测各组细胞内ROS浓度的变化；RT-PCR和Western 结果： 功；2．Westem 著增加、细胞内MDA含量升高，同时细胞内ROS含量显著增加，CAT、SOD 及GPx的酶活性下降，与相应的Control组比较均具有显著性差异(尸O．01)。 摘要 存率较未转染H9e2细胞的sI／R组明显上升、LDH漏出量显著降低；同时，细 Western 胞比较均存在显著性差异(pO．01)。 结论： 稳定高表达能对抗sFR诱发的氧化应激损伤，其机制可能是通过上调抗氧化酶 以实现。 关键词：DJ．1；模拟缺血再灌注损伤(sI瓜)；氧化应激；H9c2细胞；稳定转染 注：本文受到国家自然科学基金(N_o和江西省自然科学基金(No： 2010GZY0220)资助。 III ABSTRACT objective： Toconstructthe vectorofDJ-1 andestablishthe eukaryoticexpression gene H9c2celllinewhich further whetherDJ—l DJ-1，and stablyexpresses explore attenuatessimulated oxidative over-expression stress． Methods： 1．Full eDNAofratDJ-1was RT-PCRwimtotalRNA length amplifiedby extractedfromtheH9c2cellsandclonedinto vector eukaryoticexpression recombinant wasidentified pFLAG-CMV-4．TheplasmidpFLAG—CMV·4·DJ一1 by PCRandDNA recombinantWas colony sequencing．Subsequently,theplasmid transfectedintoH9c2 G418selectionfor2 stableclones cells．Following weeks，two oftheDJ—l andH9c2／DJ—l—B)andonestablecloneofthe transfectants(H9c2／DJ—l—A sham