APP+apxIVA基因序列特性及rApxIVA%2frTbpB亚单位复合菌苗对小鼠免疫及研究.pdf

摘 要 猪传染性胸膜肺炎(Porcine InfectiousPleuropneumonia 肺炎放线杆菌(Actinobacillus 道传染病，是猪急性呼吸道疾病发生的重要原因。由于引起PIPS的病原血清型众多，毒 力因子复杂，不同血清型细菌毒力因子构成不同，使疫苗免疫难以达到令人满意的效果。 基因序列特性开始，采用PCR方法成功扩增APP nfn清1型apxlVA基因5’端两个特征性氨基 酸序列(N端疏水性区域和中部乙酰化位点区域)的编码序列，构建这两段序列的表达 mmol／L IPTG浓度条件下诱 tbpB．pET32a载体分别转化表达宿主菌大肠杆菌BL21，在0．6 导3h表达重组蛋Et i rApxIVAl ‘’ ；：． rTbpB具有良好的抗体反应原性，rApxWA2的抗体反应原性很弱。 ， rApxIVAl和rTbpB作为亚单位疫苗按25p∥只／次的剂量分三次免疫小鼠，每次间隔 两周，抗体监测结果表明两种重组蛋白单独或者是联合免疫小鼠都能诱导机体快速产生 高水平抗体，在二免两周后抗体水平就达到活菌感染诱导机体产生的抗体水平。用APPl 型4074株培养物制备灭活疫苗免疫小鼠(4X108CFXd／只)，免疫方法同重组蛋白。抗体 能诱导CPSl抗体产生。将重组蛋白与细菌培养物混合后制备亚单位复合菌苗免疫小鼠， 抗体监测结果表明，灭活苗不会影响重组蛋白诱导机体产生抗体的能力；重组蛋白的添 加，对灭活疫苗中部分抗原诱导机体产生抗体的能力有一定影响。在所检测抗体中，灭 力不受影响。三免后MTT法分析各免疫组小鼠脾细胞增殖能力，结果表明重组蛋白的添 加量对脾细胞增殖能力有影响，重组蛋白50 pg)免疫组小鼠脾 txg(rTbpB永lrApxWAl各25 pg免疫组；25gg 细胞增殖能力最强，重组蛋白25昭免疫组小鼠脾细胞增殖能力低于50 免疫组中，不同重组蛋白免疫效果差异不明显；在所有免疫组中，灭活苗免疫组小鼠脾 细胞增殖能力最弱。 攻毒试验结果表明，重组蛋白对同型(1型)细菌攻毒具有一定的免疫保护作用， IV 护率，两者联合免疫能提供的免疫保护率为40％。灭活疫苗单独免疫提供的保护率为 率为80％，重组蛋白能提高灭活疫苗的免疫保护率。对攻毒后死亡小鼠肺脏和存活一周 的小鼠肺脏带菌量进行定量检测，结果表明不同疫苗免疫对APP的清除率不同。rTbpB 免疫有助于降低细菌在肺脏的定殖能力，灭活疫苗免疫组小鼠肺脏带菌量在攻毒后一周 变化不明显，rApxlVAl免疫组小鼠肺脏带菌量在攻毒后一周出现明显上升。对于不同血 清型(6型)攻毒，研究中所使用疫苗免疫后都不能产生很好的保护作用，除 rApxIVA／rTbpB单位复合菌苗免疫组有一只小鼠存活外，其余均在攻毒后死亡。 在对apxlVA基因3’端片段的克隆研究中，发现该片段在基因组外复制时具有特殊性， 即PCR扩增能形成不同大小的扩增片段，T克隆后重复序列缺失重复结构。序列分析表 明，apxlVA基因重复区域序列由4个重复单元组成，长度分别为159bp、144bp、135bp bp)(P135bp)】m[(P144 or1、n1)。 在紧邻重复区域的序列中设计引物扩增该重复区域，电泳显示PCR扩增产物中有多种扩 增条带。回收1型4074株扩增产物中约1800 bp、1200bp和600bp的三种片段，