嵌合体真核表达质粒pVAX1-SSG构建以的在真核细胞中表达.pdf

遵义医学院2007届硕士研究生论文 缩略语表 遵义医学院2007届硕士研究生论文 嵌合体真核表达质粒pVAXI-SSG的构建以及在真核细 胞中的表达 摘要 龋病是一种以细菌为主的多种因素导致的牙体硬组织的慢性感染性疾病，变 形链球菌是目前公认的主要致病菌之一。变形链球菌在牙面的粘附、聚集、增殖 和产酸是其致龋的主要原因。阻断牙面粘附、聚集过程，可降低龋病的发生率。 目前认为，免疫学预防措施是控制龋病的主要手段之一。基因疫苗是上世纪90 年代发展起来的一种诱导免疫反应的新方法，是人类免疫预防医学史上的又一重 大进展，被誉为第三次疫苗革命。其基本原理是将外源性基因直接导入宿主细胞 内，诱导宿主免疫系统对目的基因所表达的蛋白产生免疫反应，从而达到预防和 治疗疾病的目的。 表面蛋白spaP和spaP样蛋白是变形链球菌的主要枯结素之一。为一类分子结 构和生物学功能相似的蛋白质家族，主要与变形链球菌在牙面初始粘附、菌斑形 成及龋病的发生密切相关。它的不同状态可影响细菌粘附，它参与了变形链球菌 在获得性膜上蔗糖非依赖性桔附。它的主要粘附功能区和免疫活性区集中在其氨 基末端富含丙氨酸的A区和中间部分富含脯氨酸的P区。 变形链球菌葡聚糖结合蛋白 Gbps 是变形链球菌的主要致龋毒力因子之一， 通过与细菌产生的细胞外多糖一葡聚糖结合而介导细菌在牙面的粘附和聚集。它 参与了变形链球菌在获得性膜上的蔗糖依赖性粘附。目前，已有四种不同的Gbps 这四种葡聚糖结合蛋白的分布不尽相同，确切的功能还不很清楚。GbpA是这四种 葡聚糖结合蛋白中研究较为清楚的，它的核酸序列己被克隆并得到了相关蛋白分 子的氨基酸序列，而且，研究发现GbpA的葡聚糖结合区 GBD 可能为介导变形 链球菌粘附的重要功能区。因此，如果能同时抑制SpaP和GbpA的功能，就能在一 定程度上阻断变形链球菌对牙面的非蔗糖依赖性粘附和蔗糖依赖性粘附，从而达 到预防龋病的目的。 区 葡聚糖结合区GBD 的编码区基因片段g厢ISpaP的P区编码区基因片段印，并 逮义医学院2007届硕士研究生论文 将这两个片段连同一段信号肽序列同时克隆到真核表达载体pVAXl，构建pVAXl ～sSG真核表达质粒作为基因疫茁，进行真垓表达融合蛋白的检测，为下一步嵌 合体防龋DM疫茁免疫哺乳动物获得特异性抗体及抑龋实验研究做准备，并为其 在免疫防龋中的进一步研究及应用打下实验基础。 【方法】本研究共分为三个实验； 实验一s变形链球菌tlAl59GbpA的蝴区基因和SOaP的P区基因的克隆 和序列分析 报道的序列设计两对弓I物，采用PcR方法扩增GbpA的功能区 葡聚糖结合区G8D 的编码区基因片段g痢SpaP的P区编码区基因片段印；采用重叠延伸PcR法扩增信 DH5 化感受态细胞EcoHa，挑取阳性克隆，初步鉴定后测序。 实验二：嵌台体防龋D姒疫苗pVAXt—s∞真核表达质粒的构建 将测序正确的signal，嚣帮印的基因片段分别双酶切，胶回收纯化后将同样 进行双酶切的pVAXl质粒在T4蜊A连接酶作用下进行连接反应，获得构建的嵌合体 d，提取纯化pVAXl--SSG， 防龋DNA疫苗pYAXI-SSG，并转化感受态细胞EcollDH5 进行质粒Rc＆酶切电泳鉴定并测序。 实验三：变形链球菌嵌合体襄核表达质粒pVAXl-SSG在真核细胞中的 表达 ’ 通过转染试剂将表达载体转染至哺乳动物细胞COS-7中．用RT—PcR法检测重 组基因在细胞内转录的情况，采用免疫组化染色检测细胞中pVAXi-SSGij的蛋白 表达情况。 【结果l利用PCR技术。克隆到船和焉湛因，和一段信号肽基因；序列分析结果 与设计基因序列一致；通过双酶切后连接反应，成功构建了嵌合体真核质粒 疫组化染色，证实pVAXl-SSG质粒能在宿主细胞中表达出相应的抗原蛋白。 【结论l成功构建了嵌合体真核质粒pv^】【1-SSG将重组质粒，质粒转化哺乳动 物细胞后。能转录和表达相应的抗原蚤自。 3 遵义医学院2007届硕士研究生论文 【关键词】 变形链球菌；表面蛋白抗原P；葡聚糖结合蛋白A；嵌合 体防龋疫苗；蛋白表达 本研究为贵州省优秀青年科技人才基金项目‘口服型基因防龋疫 苗的研制》和贵州省教育厅重点资助项目‘口服型DNA防龋疫苗的实 验研究》的部分内容 遵义医学院2007届硕士研究生论文 Constructionof and eukaryoticpVAXl-SSGexpression plasmid ‘offusionalinthe cell proteineukaryotic Oralmedicine Major： Chai Qiaoxue Supervisor：Pr