松材线虫纤维素酶致病机理.pdf

中文摘要 摘要 松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)是松树的一种灾难性病害的病原生 物，是引起松树萎蔫病的主要原因，但其致病机理目前说法不一，主要集中于毒 素学说、空洞化学说和酶学学说等三种不同观点，并且大多数结论都是建立在疫 木形态学变化的基础上，未能在分子水平上阐明其内在机理。近年来松材线虫纤 维素酶的研究一直是松材线虫病病理学研究的一个热点，并取得了一定的进展。 本研究为了在蛋白质水平和分子水平上阐明该病的部分致病机理，分别从不同角 度对松材线虫纤维素酶进行了研究。 本研究首先通过形态学观察、同工酶分析、ITS．RFLP以及RAPD分析等方 法分别对来自于不同国家和地区的40株线虫进行鉴定。结果表明．通过尾尖突 的有无或形状的不同，可以初步区分松材线虫和拟松材线虫；利用谷草转氨酶的 同工酶分析可以准确地区分上述两种线虫；基于分子生物学的ITS．RFLP分析除 了可以准确地鉴定两种线虫外，还可以对拟松材线虫的地域特征作出判断，划分 为亚洲型和欧洲型；而RAPD分析不仅能区分两种线虫，还可以描述各种松材 线虫和拟松材线虫种内以及种闯的遗传进化关系。借助RAPD分析结果，我们 确定了具有代表性的安徽滁州马尾松(P 中的松材线虫(No．12、No．13)以及四川邻水华山松(Parmandii)中的拟松材 线虫(No．16)作为后续的研究的材料。 为了阐明松材线虫分泌的纤维素酶在松树疫木的病理学研究上的重要地位， 本研究通过丙酮沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等方法对松材线虫纤维素酶进行 比活力为100．27U／rag，与纯化前的粗酶液的比活力相比提高了10，4倍，纤维素 酶活力的回收率为23．9％。以纤维素酶BXC60为指标，利用抗松材线虫总蛋白 抗体(Anti．BX)，本研究建立了一种选择性抗体酶联免疫分析法(SAE认)，并 显示了较好的特异性。利用该方法可以检测出疫木中存在的纤维素酶，其检测灵 敏度为O．1I．tg／well，为松材线虫的研究提供一种简便、快捷地的手段。 取免疫小鼠的脾细胞总RNA，通过抗体工程的方法，构建了库容量约为5×104的 单链抗体库。以BXC60为靶标进行筛选，获得seFv基因，并通过基因工程的手段， 进一步将seFv与EGFP进行融合表达，获得了既具有绿色荧光的特性，同时具有 与BXC60特异性反应功能的双功能融合蛋白。利用Anti—BXC60血清进行的免疫 组化的结果表明，纤维素酶在线虫的食道腺处有很强信号反应，并且在吻部有微 弱的信号，说明该酶可能产生于食道腺，并由口针向体外分泌。与此同时采用 中文摘要 scFv．EGFP进行松材线虫活体染色的结果也显示，食道腺处可观测到明显的绿色 荧光信号，与上述结论相吻合。 进一步利用Anti．BX和Anti．BXC60两种抗血清，对松材线虫分泌物进行免 疫学分析，结果显示，松材线虫可以通过分泌孔向体外分泌大量的可溶性蛋白； 而纤维素酶的分泌则是通过口针向体外分泌。疫木切片的免疫组化染色结果显 示，天然感染松材线虫的疫木样品中，含有大量的松材线虫蛋白抗原，其主要集 中于纵向管胞细胞中，而致病性的纤维素酶抗原，则主要分布于管胞、树脂道和 射线细胞中，表明松材线虫在感染松树的入侵初期，主要沿树脂道、射线及管胞 细胞在树体内作横向或纵向的移动。 不同来源的松材线虫纤维素酶基因翩0，0、BXCl2和BXCl3。与报道的日本线 虫的纤维素酶基因Bx-eng-3进行比对分析后发现，四种纤维素酶基因的同源性 42个碱基的部分重复序列。分别将上述四个基因转入毕赤酵母进行表达，所表 达的纤维素酶的活力相当，说明这种重复序列的缺失并不影响纤维素酶的活力。 进一步经10L发酵罐发酵表达制备纤维索酶BXCl0，发酵液比活力为7．70U／rag， 并可以有效水解松木切片中的纤维素，平均每单位纤维素酶在24h内可以产生 174-3．5ng还原糖。环境扫描电镜和x一射线小角散射的分析结果发现。切片表面 随着时间的延长变得粗糙，纤维素结构变得稀疏，证明该酶能够破坏细胞壁，具 有明显的致病能力，为松树萎蔫病的重要的致病因子之一。 综上所述，本研究从松材线虫的分离鉴定入手，选择代表性的线虫分离纯化 其纤维素酶，并制备相应的纤维素酶抗体和seFv单链抗体，利用免疫组织化学 方法，从蛋白水平上阐明了松材线虫纤维素酶的合成部位、分泌方式和侵染途径。 进