P12细胞系基因表示微排列的设计、制造及其应用.pdf

摘要 ／90年代兴起的人类基因组计划已经将人类数万个不同基因的序列信息展现 在我们面前。但是，由于细胞发展过程受控于表达基因指令、表达水平和表达 时间的调配，单靠序列信息并不足以全面阐释基因功能、表达、调控及结合位 点变化等多方面的信息，所以用以平行分析大量遗传信息的实验工具显得尤为 重要。基因芯片技术的出现，不仅能利用基因组计划的研究成果在疾病诊断、 药物筛选等领域发挥重要的作用，而且还可为蛋白组计划的实施提供大量非常 重要的线索√旧前，基因表达芯片技术的发展使得对基因表达的研究更加深入 和规模化：这一技术正被广泛应用于新药开发、人类疾病、生物物种改良和药 效、药物专一性及药物毒理的研究中。 ， 我们开发了一种基于寡核萤酸芯片杂交的方法j，『具体方法如下：利用点样 仪将寡核苷酸探针固定于经化学修饰的玻片上。在RNA反转录为eDNA过程中 掺入荧光染料Cy．3或cy．5．dUTP，荧光标记靶标与固定的寡核苷酸探针在经过 试验确定的严格条件下进行分子杂交。随后用特定激发波长的激光光源激发， 发射出的荧光用激光共聚焦显微镜扫描，所得图像输入软件，进行数据分析。∥) 本论文的新颖之处在于设计和应用了70-mer的寡核苷酸探针，同时我们 交信号很强。以i 本文的另一创新之处在于我们将表达芯片技术应用于神经生长因子刺激的 RNA并用三种方法对其进行质量控制。从PCI2细胞的上百个基因中，我们选 择了近40个代表性的基因作为实验探针，包括捌激早期表达基因及一组功能相 反的基因，并以管家基因作为信号参照标准。在反转录过程中，用直接法标记 cDNA，并在此基础上尝试了非直接标记法。通过不断优化杂交温度、时间、杂 交液盐离子浓度和其它与严格度相关的条件，我们已经获得了比较稳定的结 果。 综上所述，本论文的主要工作如下： 1．为基因表达芯片技术的研究，特别是在寡核营酸表达芯片的设计、制备和 应用方面提供了一套系统方法。 2．利用寡核苷酸芯片分析了近40个PCI2细胞的特殊基因，为生物学研究和 医学诊断学发展提供了新的思路。 3．尝试应用非直接标记技术提高杂交过程中荧光标记的效率。 4．测试了不同长度和不同位置寡核苷酸序列的杂交信号以优化探针选择原 则。实验中不断优化各种杂交条件，并且获得了较好的杂交结果。 关键词：基f因表-达，亳鳖!孽芯片，!堂皇粤长因子，PC—1—2一胞系，神l凳分化 秽。 Thehuman encodesscoresofthousandsdifierent genome genes， for a11havebeen andatleast information partialsequence nearly fora available information insumcient nOW．Sequencealone，however,iS full of splice- gene understanding sitevariation．Becausecellular are the governedby repertoire processes and of is of thelevels timingexpression