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蓝舌病病毒内蒙分离株VP：基因 5’端片段的克隆、序列分析及地高辛探针检测 研究生：武建强 指导教师：李充璧 摘要 根据蓝舌病病毒已报道的外壳蛋白VP，基因序列保守区设计 合成两对引物，以蓝舌病病毒内蒙分离株总RNA为模板，逆转录 合成cDNA第一链；经PCR扩增并回收扩增后的DNA片段，与 pGEM．T载体连接构成重组质粒，转化大肠杆菌JMl09；筛选出含 有插入片段的重组质粒，用PCR法鉴定后，获得了带有蓝舌病病 毒内蒙分离株外壳蛋白VP，基因部分片段的cDNA克隆，序列分 析表明此片段长为249bp，与蓝舌病病毒澳大利亚株同源性为 40％。用结合地高辛的11．dUTP标记克隆的蓝舌病病毒内蒙分离株 cDNA片段，制备成探针，通过核酸斑点杂交对粗提取的不同来源 蓝舌病病毒RNA进行了检测，结果表明此探针对蓝舌病病毒内蒙 株具有特异性，且灵敏度高，可探测出50pg的病毒RNA。本研 究为蓝舌病病毒内蒙分离株的进一步研究、蓝舌病病毒感染的诊断 和内蒙分离株的鉴定创造了必要的条件。 ，—、 娆 关键词：蓝舌病病毒内蒙株；VP2基因；f克隆；核酸杂交 本项目由国家自然科学基金资助(3966002) 刖吾 现代分子生物学技术的不断发展为病毒病原体的研究提供了多 种手段。对于研究未知序列变异程度的病毒分离株来讲，利用克隆 技术来克隆并测定其特定片段的序列，是进行基因全序列测定等研 究工作的基础161；而利用此特定片段作为探针杂交对未知病毒进行 鉴定，则具有很大的实用意义【8，“·”】。 蓝舌病病毒(B1He Virus)为双股RNA病毒，是感染家畜 Tongue 及野生反刍动物的虫媒病毒，是呼肠孤病毒科坏状病毒属的代表成 员，迄今己发现本病毒有25个血清型。其基因组含有10个分子量 大小不等的双链RNA片段，分别编码7个结构蛋白(VPl-VP7) 和3个非结构蛋白(NSl．NS3)U7】。其中外壳蛋白VP2由其基因 组的L2片段编码，在诱导抗体对病毒的中和反应方面起主要作用 [5,2 Sl。VP2基因在不同的血清型、不同地域、甚至不同年份之间变 异很大[27I，对蓝舌病病毒地方株VP2基因的研究，在确定病毒当 地株的分子遗传学背景、疫苗研制及当地株基因全序列的测定方 面，均具有重要的价值。 VP2基 蓝舌病病毒澳大利亚分离株血清型1和美国分离株10 因的序列分析表明，尽管L2片断的长度略有差别，但两端都含有 特征性保守序列14I。蓝舌病病毒澳大利亚分离株血清型1和美国分 VP2基因序列的 完成…”。对比分析表明，尽管BTV一1和BTV一10 同源性并不高，但其整体肽链组成非常相似。文I献显示，VP2基因 变异程度较高，可以随不同地域或同地域不同年份而发生变异 110,1∽，I。对于本地区来说，内蒙古地区蓝舌病病毒分离株的克隆、 序列测定及探针制备将对本地区蓝舌病防治具有重大意义。因为在 已获得BTV内蒙古分离株的基础上，与其他地区分离株问作基因 序列间的比较性研究有助于阐明本地毒株的变异及分子进化；由于 51,针对内 VP2蛋白在诱导抗体对病毒的中和反应方面起主要作用12 蒙分离株VP2基因变异性的进一步研究对于疫苗研制等具有重要 的实用意义。目前蓝舌病病毒内蒙分离株VP2基因3’端部分序列 7 的克隆及其同源性分析已由本实验室完成，与BTV．1L2片段3、 端序列比较，同源性为47％；与BTV一11型的L2 3、端序列比较， 同源性为44％…I。在此基础上，进一步克隆蓝舌病