不同培养条件对植物乳杆菌P8产共轭亚油酸及LAI基因mRNA表达水平影响.pdf

摘 要 共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是几何构型和共轭双键的十八碳 二烯酸上存在差异的，具有多种生物活性的天然脂肪酸。 近些年来的研究发现，共轭亚油酸作为一种不饱和脂肪酸，具有抗癌、提高免疫 力、增加肌肉、降低脂肪和胆固醇、防治糖尿病、提高骨骼的密度、抗动脉粥样硬化 等多种生理功能，同时在保健品、医学领域、食品、化妆品和饲料工业等领域有着重 要的功能和广阔的实际应用前景。研究亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase LAI) 作为共轭亚油酸生物转化的一种关键酶有着至关重要的意义。 迄今为止，在亚油酸异构酶(LAI)的结构、功能、性质和调控各方面的研究，大 多数利用基因工程和生物工程方面的技术对亚油酸异构酶(LAI)进行多方面优化处 理。目前，研究表明微生物可以利用自身的条件将亚油酸(LA)，通过亚油酸异构酶(LAI) 专一性的催化作用转化为共轭亚油酸(CLA)，近年来在这方面的生物合成法研究甚少， 已经成为未来该领域的发展趋势。 本研究以植物乳杆菌P8 (Lactobacillus plantarum subsp.plantarum P8)作为研 究菌株，以培养时间、接种量、碳源、氮源、LA 浓度、pH 值、培养温度等诱变条件 为衡量指标，采用单因素和正交试验确定了植物乳杆菌P8 的最佳发酵条件。实验结 果表明，产共轭亚油酸的最佳发酵条件是：培养时间为22h、亚油酸(LA)添加量为0.9 mg/mL、接种量为1.5%、氮源采用2g/L 的胰蛋白胨，碳源采用3g/L 的葡萄糖。在此 条件下，植物乳杆菌P8 产共轭亚油酸的最高产量可达0.0692 mg/mL。 利用正己烷萃取法、分光光度法、Trizol 法、反转录PCR 法、Real-time PCR 等 技术，研究了植物乳杆菌P8 LAI 基因的mRNA 表达情况。对不同条件培养的16 组(正 交试验)植物乳杆菌 P8 进行总 RNA 的提取。琼脂糖凝胶电泳和分光光度法检测 RNA 的完整性和纯度，OD /OD 的比值在 1.90-2.10 之间，完全满足RT-PCR、荧光定量 260 280 PCR 等分子生物学操作的要求。设计特异性的引物，用于16 组样品的反转录PCR 扩 增，将反转录得到的cDNA 进行Real-time PCR 定量分析，检测16 组样品的LAI 基因 mRNA 相对表达量。研究表明，LAI 基因不同培养条件下的植物乳杆菌P8 中都有表达， 但表达量不同。其中第4、6、12 组LAI 基因的相对表达量较低，第1、5、10 组LAI 基因的相对表达量较高，表明不同培养条件对植物乳杆菌P8 中LAI 基因的相对表达 量具有一定的影响。 关键词：植物乳杆菌；亚油酸异构酶；Real-time PCR；mRNA 水平；差异分析 Influence of Different Cultivate Conditions on Yield of Conjugated Linoleic Acid and the mRNA Expressed Level of LAI Gene in Lactobacillus Plantarum P8 Abstract Conjugated Linoleic Acid (CLA) is a natural fatty acid which have kinds of bioactive and exists differential in geometry configuration and conjugated double bond at octadecadienoic acid . Recently researches found that, as a unstaturated fatty acid, CLA possessed many physiologic function such as canticancer, proved human’s immunity, increased muscles, cu