玉米根液泡膜钙依赖蛋白激酶的性质及其磷酸化作用对V型H-%27%2b--ATPase的调节.pdf

玉米根液泡膜钙依赖蛋白激酶的性质及磷酸化作用对V型 H+一ATPase的调节 摘要 磷酸化／脱磷酸化作川是生物体内蛋白质、酶和转录因子活性调节的重要方式， 由止它进·步调控跨膜运输、信号转导和基因表达等重要生命活动过程。植物体内催 化蛋白质磷酸化的最重要的蛋白激酶是钙依赖的蛋白激酶(CDPK)，CDPK广泛存 在十植物界，在各种细胞类型的质膜、线粒体外膜、叶绿体类囊体膜、内质网膜等 膜系统及胞质rIj均发现有CDPK的存在。对细胞中不同定位的CDPK结构与功能 的研究、对其生理底物的鉴定已成为植物细胞信号转导研究中的热点问题。一7 ／ 本论文首先创建了CDPK活性检测的新方法，从蛋白质水平和酶活性证实液 的天然生理底物之一，其活性受磷酸化／脱磷酸化的调节；V型H+一ATPase的A亚 笨的Ser525是该酶的磷酸化位点。 以C1肽和ATP为底物，创建了一种非放射性同位素体外检测植物材料中 CDPK活性的方法。所得结果与本实验室和其他实验室过去使用的放射性同位素法 均住10一mol Pi·(ragprotein)～-min。的范围之内，具有可比性和可信性。特别是本方 法尤放劓性污染，而且在可重复性、平行性和操作简单等方面均优于同位素方法， 更适合大批量的检测。 以K米(Zea L．)根为材料，采川差速离心和蔗糖密度梯度离心法分离纯 may 化液泡膜。各利t标志酶活性检测表明，制备得到的膜样品中其它内膜组分的污染很 少，是高纯度密实型液泡膜囊泡。J{j我们建立的非放射性同位素测定方法和免疫印 迹(western blot)鉴定了液泡膜上存在+种具有钙依赖蛋白激酶(CDPK)活性的 膜酬有蛋白。这种液泡膜CDPK所需的最适游离Ca”浓度为109mol／L，最适pH 蹒、坝：玉水根液泡膜钙依赖监白激酶的性质及磷酸化作用对V型lq-STPase的调节 值为6其活性位点朝向胞质一侧。实验发现以250mmol／L的NaCI对根进行盐 胁迫时，可导致液泡膜上CDPK的蛋白量迅速升高，15rain时达到最大，以后则开 始逐渐降低，至60min时仍然维持在对照的1．4倍左右，说明玉米根在受盐胁迫1h 的时问叫|，可能存在CDPK与膜的结合然后又脱离的过程。 在完蹩的液泡膜囊泡水平观察了钙依赖的磷酸化作用对V型H+-ATPase的活 性调节，发现已磷酸化的V型H+．ATPase的ATP水解活性和质子转运活性均有了 较大的提高。而且，用碱性磷酸酶处理磷酸化的液泡膜蛋白，可以使v型H+-ATPase 的ATP水解活性和质子转运活性部分复原。说明v型H+一ATPase存在磷酸化／脱磷 酸化的活性调节方式。 以硫代磷酸化为模型并引入荧光标记，证明v型H+．ATPase的A亚基是液泡 膜上可以被磷酸化的蛋白质之…。进一步使用反相高效液相色谱并结合电喷雾质谱 的磷酸化位点。这个位于C末端的磷酸化位点在各种植物v型H+-ATPase的A亚 基中的保守性很高，而且其周围的序列同样也是保守的，暗示这个位点的磷酸化／ 脱磷酸化作用可能是植物界中广泛存在的v型一一ATPase活性调节的重要方式。■ 根据以上结果可以认为，玉米根液泡膜上存在钙依赖的蛋白激酶(CDPK)， 而且这种CDPK在适应盐胁迫过程的早期发挥着重要的作用；磷酸化作用是调节v 。 型H+一ATPase活性的重要力式之 关键词：镢颡蛋白激酶：磷酸化作tE}j 液泡膜；玉米 v型H潋Pase I＼ 摘要 Located of ProteinKinase Characterization