犊牛腹泻主要病原菌毒力基因检测及其重组表达.pdf

摘要 犊牛腹泻是影响犊牛早期生长发育最为严重的疾病。大肠杆菌、沙门氏菌和 产气荚膜梭菌是引起犊牛腹泻的主要病原菌，快速检测这三种病原菌并调查其流 行的毒力基因尤为必要。本研究针对上述病原细菌建立三套多重PCR检测体系， 检测了犊牛临床腹泻样品，并采用直接分离和生物过滤分离方法分离出毒力菌 株。重点研究了产毒性大肠杆菌(enterotoxigeIlicE∞，f，ETEC)主要毒力因子耐热 肠毒素(Heat．Stable toxill，ST)和不耐热肠毒素阻eat．1abiletoxin，U’)的基因克 隆、表达，通过免疫学实验证明了重组抗原具有良好的抗原性。 犊牛腹泻主要病原菌多重PCR检测方法的建立。为迅速检测犊牛腹泻的主要 病原菌和分析其流行的毒力基因，建立了三套多重PCR检测体系： s戗2一k99毋l-st)ci、St-t删A—eae—n帮cpb-plc-e扛。 蒯．椤9∥J哂所』检测体系：实验选取ETEC的矽灭．∥J基因，产志贺毒素 E 大肠杆菌(Sbjgatox洫-producingcD厅，STEC)的s白口、J红J基因作为扩增靶基因， 通过优化反应条件建立了四重PCR检测体系。对PCR产物回收、测序，验证PCR。 多重PCR检测相关阳性菌株和阴性菌株的结果与其己知的基因背景一致。通过 分别为：1×104CH7／西】、5×103CFl7／ml、2×104CFl7／m】。 赂切鲥一阳P．厅检测体系：实验选取ETEC的盯、厅基因，致病性大肠杆菌 E EcD府， (enteropa也og面c E髓C)的8口P基因同源区序列和沙门氏菌的砌谢基因作为扩增靶基因，通过优 化反应条件建立了四重PCR检测体系。对PCR产物回收、测序，验证PCR。多 重PCR检测相关阳性菌株和阴性菌株的结果与其己知的基因背景一致。通过平 1×104CFUM和2×104CFU／m1。 印6巾纪．口红检测体系：实验选取产气荚膜梭菌的印6、p纪、e肛基因为扩增靶 基因，通过优化反应条件建立了三重PCR检测体系。对PCR产物回收、测序， 验证PCR。多重PCR检测相关阳性菌株和阴性菌株的结果与其已知的基因背景 一致。通过平板计数确定多重PCR对B型产气荚膜梭菌能够检出的最小浓度为 5×103CH7／bI。 本研究表明犊牛腹泻主要病原菌的多重PCR检测方法具有快速、特异且敏 感的特点，可用于犊牛腹泻的快速检测。 临床样品的PCR检测与细菌分离鉴定。为了调查犊牛腹泻的主要病原菌及其 流行的毒力基因，利用建立的三套多重PCR体系检测了59份犊牛腹泻样品，结 果显示病原性大肠杆菌是引发犊牛腹泻的主要病原菌。通过直接分离和生物过滤 法分离，均能够从样品中分离到毒力菌株。在样品T1、，r2、XLl中分离到同时 携带mJ和P韶的大肠杆菌；在样品T3中分离到同时携带s船、mJ、g韶的大 肠杆菌和携带矽纪的产气荚膜梭菌；在样品X1、X5中分离到携带厅的大肠杆菌； 在样品X2、Wl中分离到携带P口8的大肠杆菌；在样品X4中分离到同时携带s舶、 e傩、硪J、盯的大肠杆菌和携带础的产气荚膜梭菌；在样品Q3、Q4中分离到 携带砒的大肠杆菌。 大肠杆菌肠毒素ST、LTB融合基因的克隆、表达和免疫原性初步研究。ETEC 是引发犊牛腹泻常见的主要病原菌，肠毒素ST、LT是其主要的毒力因子。实验 用PCR的方式获得盯和地基因序列，再用重叠PCR的方式获得其融合基因 s卜力曰，并在两者之间加入了编码柔性多肽G．G．G．S．G．G—G．S的LiI墩er序列。将 载体上酶切下来，连接到表达载体pMal．p2x上，转化到表达菌株Tbl中。采用 T0x砸 作为一抗血清(LTB与CTB的氨基酸有80％的同源性)，以羊抗兔IgG作二抗， 免疫印迹检验结果为阳性，从而进一步证明了融合蛋白的表达。通过优化表达条 件，最终确定碑TG终浓度为0．41mmo儿、31℃、诱导8h可以获得最大的表达 量，目的蛋白约占可溶性蛋白总量的13．4％。使用缸nylose柱亲和层析纯化目的 蛋白。以纯化后的目的蛋白作为抗原腹腔注射小白鼠100“g／只，两周免疫一次， 同时免疫7组小鼠