人蛔虫提取物抗肿瘤作用及其机制的实验研究.pdf

摘要 摘要 目的： extractofAscaris 通过体内外试验，探讨人蛔虫提取物(body lumbricoides， BEAL)对小鼠LLC细胞株的细胞毒作用，建立小鼠LLC荷瘤模型，探讨人蛔虫提 取物对肿瘤的作用及其免疫学机制。 方法： 1．人蛔虫提取物的制备：对蛔虫感染者一次口服双羟萘酸噻嘧啶(30mg／Kg 体重)，服药后从粪便中收集蛔虫成虫。取完整的蛔虫洗净后用含100U／InJ青霉 素、链霉素的无菌生理盐水浸泡15分钟，滤纸吸干，在超净台内解剖蛔虫，取 出内脏丢弃，收集虫体，，时匀浆器搅碎后，在10，000×g离一L,30分钟，取上清， -30℃储藏备用。 1-6)和小鼠淋巴瘤细胞株(EL4)均购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。 用四氮唑盐酶还原法(microculturetetrazolium test,MTr)检测人蛔虫提取物对三 种肿瘤细胞的细胞毒作用，以筛选出最敏感细胞株和最佳作用浓度。 3．绘制LLC细胞生长曲线：取对数生长期的LLC细胞常规消化，用RPMI． 中，lml／孑1．,，置37℃、5％C02的细胞培养箱中培养。每天取三孔细胞进行消化后 计数，取平均值，连续观察7d。其余细胞隔2d换液，根据所得数据绘制细胞生 长曲线。 4．LLC细胞毒性实验：取对数生长期的LLC细胞消化后，用 RPMll640+1 置37℃、5％C02的细胞培养箱中培养24h，弃去孔内液体，加入不同浓度的 Ⅱ 摘要 导实验的起始浓度。 5．荷瘤小鼠模型的建立：将LLC细胞株扩增后对小鼠进行肿瘤造模：以细 X 胞密度为1 107／wa，0．1ml／只，接种于小鼠右前肢腋下皮下。 6．实验分组：A组一人蛔虫提取物事先干预组(BEAL+LLC)：腹腔注射浓 LLC细胞悬液，0．1ml／只，接种于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用BEAL干预，隔 X 107／rra 天一次；D组一肿瘤造模后生理盐水干预组(LLC+NS)：以细胞密度为l 的LLC细胞悬液，0．1ml／只，接种于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用生理盐水干预， 隔天一次；E组一阴性对照组，正常饲养，不加任何处理。10d后处理各组小鼠进 行实验。 ‘ 7．巨噬细胞的分离和培养：常规无菌状态(详细见下文)制备小鼠巨噬细 密度为1×106／IIll，收集于24孔培养板中，置37℃、5％C02培养箱中培养。 8．脾淋巴细胞的分离和培养：常规无菌状态制备小鼠脾细胞，加入含有 ／lnl，收集于6孔培养板中，置37℃、5％C02培养箱中培养。 9．细胞因子的表达：巨噬细胞和脾淋巴细胞培养72h后收集上清，用ELISA 法检测各实验组培养上清中TNF．Q、IFN吖、IL-4、IL．10的表达。 10．LLC细胞有丝分裂指数：普通光学显微镜下观察有丝分裂相细胞，取 细胞数多、中、少3个区域各一区，共计数1000个细胞，计算出细胞有丝分裂 指数(mitoticindex,MI)。 11．胸腺和脾脏指数：人蛔虫提取物干预荷瘤小鼠，10d后取出小鼠胸腺、 脾脏称重(mg)，分别除以小鼠体重(g)，得到胸腺指数和脾脏指数： 12．统计学分析：用SPSSl3．0处理各组实验数据，对上述实验结果进行统 计学分析。实验结果以均数±标准差(x+S)表示。细胞毒实验数据转化为细 胞杀伤率后采用方差分析(F检验)，HE染色计算细胞分裂指数所得数据做平方 III 摘要 根反正弦转换，然后进行方差分析。ELISA数据直接进行方差分析，样