日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白L251的表达纯化及生物学活性鉴定.pdf

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白L251的表达纯化及生物学活性鉴定 中文摘要 本实验室早期建立了日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库，我们通过对文库中的 cDNA序列和部分EST功能基因片段分析发现，日本七鳃鳗口腔腺中存在着大 量中性粒细胞抑制因子(NIF)样蛋白质，将其命名为L251。接下来的结构预测 蛋白亚家族，结构上具有经典的CRISP家族的特点，即：包含有PR．1结构域、 一个铰链区和一个半胱氨酸丰富结构域(CRD)。进一步的生物信息学分析发现， L251蛋白和NIF具有同样的保守序列和功能位点。 由序列特异性和载体本身固有的酶切位点特异性设计引物，从cDNA文库中 把L251功能基因钓取全长基因，连接到pET23b表达载体上，进一步转化至大 肠肝菌BL21表达菌中，接下来通过过柱亲和层析纯化、蛋白质变性和复性得到 性粒细胞趋化反应中，L251在可有效的抑制中性粒细胞迁移。此外，通过将目 的基因构建到pEGFP．N1载体上，采用脂质体2000的转染方法将目的基因导入 HUVEC细胞内，并通过荧光显微镜和WesternBlot方法分别从基因和蛋白角度 检测转染情况，结果显示目的基因已转入HUVEC细胞内，并能够表达。由此构 建一模拟体内内环境的单层细胞膜生物模型，进一步采用流式细胞仪检测L251 蛋白抑制中性粒细胞跨膜迁移的生活学活性。实验结果显示，L251蛋白能够与 中性粒细胞结合来抑制中性粒细胞的跨膜迁移。 日本七鳃鳗营半寄生生活，靠其吸盘附在其它鱼体上，并由舌上的角质 齿锉破鱼体，吸食其血与肉，有时被吸食之鱼最后只剩骨架却仍不能发觉 七鳃鳗的存在。这是不同于以往寄生生物的具有免疫逃逸机制的新物种，其口 腔腺分泌大量的L251蛋白，可能会为七鳃鳗营寄生生活逃避宿主免疫提供便利 条件。L251蛋白中性粒细胞抑制因子活性的测定，将会为以后的免疫调节剂的 药物开发做出巨大贡献。 关键词：七鳃鳗中性粒细胞抑制因子cDNA文库生物模型跨膜迁移 日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白L251的表达纯化及生物学活性鉴定 Abstract cDNA of wasestablishedour in The 1ibraryLamprey by laboratoryearly， a factor(NIF)一1ike L251，which neutrophilinhibitory protein，called isolatedfromthebuccal of is to belong glandsLampetrajapoMca．L251 Cysteine—richsecretory protein structure and aretwo 1(PR一1)by sequenceanalysis．CRISPs prediction domain withastructuralsimilar evolut diverse proteins ly yet ionary domain N—terminalandacharacteristic C—terminal cysteine—richdomain， whichwerefertoasthe domain．The conserved Crisp complete sequence andfunctionalsitesbetweenL251andNIFweredetermined and