CD163它蛋白在PRRSV感染细胞过程中相互作用.pdf

山东农业大学博士学位论 中文摘要 猪繁殖与呼吸综合征 （Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS ）又名 “蓝耳病”。是由 PRRS 病毒 （PRRSV ）感染所致的一种接触性传染病。该病以繁殖障 碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。其病原 具有典型的嗜单核细胞/ 巨噬细胞特性，在体内，PRRSV 主要感染猪肺泡巨噬细胞 （Porcine alveolar macrophages, PAM ）,在体外，主要感染非洲绿猴肾细胞系MA-104 及 其衍生物Marc-145。PRRSV 感染宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异受体结合， 利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。至今，已报道了四个独立但功能相关的 PRRSV 细胞受体。唾液酸粘附素 （Sialoadhesin, Sn）、似肝磷脂蛋白 （Heparan sulphate ， HS ）、 波形蛋白 （Vimentin ）和清道夫受体 （CD 163）。研究发现 HS 主要作用是吸附 PRRSV 到PAM 细胞上，Sn 则介导病毒的内吞，CD 163 可能协助Sn 内吞，病毒脱衣壳和将基 因组RNA 释放到细胞质中的作用。我们导师周恩民教授通过免疫共沉淀用单克隆抗独 特型抗体Mab2-5G2 （Mab2-5G2 ：针对抗GP5 抗体）在猪肺泡巨噬细胞和Marc-145 中 提取到一个分子量约为230kD 的蛋白质，可能是PRRSV 的一个新的受体，经质谱分析 和测序确定为非肌肉肌球蛋白ⅡA （Non-myscle myosin ⅡA，NMHC ⅡA ）。在动物体内， 非肌肉肌球蛋白Ⅱ有三种异构体：ⅡA，ⅡB ，ⅡC 。此蛋白广泛分布在整个生物体内， 在细胞的吸附，迁移和胞质分裂中发挥重要的作用。可溶性CD 163 与非肌肉肌球蛋白重 链A 型存在着相互作用，但是，迄今为止CD 163 受体参与病毒结合的部位，病毒上参 与受体结合的蛋白及其结合部位，受体与受体之间的关系以及 CD 163 受体与我们发现 的新蛋白非肌肉肌球蛋白的结合部位还不得而知。 为确定 CD 163 受体在PRRS 病毒侵染过程中的作用以及与非肌肉肌球蛋白之间的 关系，本实验分别从猪肺泡巨噬细胞（PAM ）和非洲绿猴肾细胞（Marc-145）中经RT-PCR 扩增出编码CD 163 受体的全长基因，并克隆到pcDNA3.1/V5-His A 载体中，得到表达 CD 163 受体的真核表达载体。猪肾PK-15 细胞和幼仓鼠肾细胞BHK-21 为PRRSV 非易 感细胞系，将表达载体转染PK-15 和BHK-21 细胞后接种PRRSV，然后利用PRRSV 的 核衣壳蛋白 （Nucleocapsid ，N ）的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测病毒的情况。结果 发现表达CD 163 蛋白的PK-15 细胞/BHK-21 细胞能够感染PRRSV。并且发现，CD 163 在PK-15 和BHK-21 细胞中的转染效率是有很大差 的，CD 163 在BHK-21 中的转染效 1 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 CD 163 及其它蛋白在PRRSV 感染细胞过程中的相互作用 率约为 10%，而在PK-15 中的转染效率约为30% 。在此基础上，共转染全长的CD 163 和真核表达的非肌肉肌球蛋白ⅡA 羧基端330AA 的蛋白PRA 于非易感细胞系BHK-21 ， 按 100TCID50 接PRRSV-12#，通过间接免疫荧光实验发现病毒感染量增加。以上实验 结果显示CD 163