hrp基因表达、进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究.pdf

辣根过氧化物酶基因的表达，进化夏其催化苯胺类化合物象合反应的研究 摘 要 一、研究的背景及意义 胺(PANI)的合成。苯胺类聚合物可采用化学合成法，也可采用酶催化法合成。化学合 成法主要包括，化学氧化聚合、电化学聚合、乳液聚合、反向微乳液聚合、缩合聚合和 模板聚合等。酶催化合成法主要采用过氧化物酶催化合成聚苯胺。采用不同的聚合方法 得到了导电性、溶解性等性能不同的聚苯胺。酶催化合成只需常温常压和温和的反应条 件，催化效率高，对底物和产物的立体专一性强，副反应少，产物易于分离纯化。酶催 化反应代替化学合成反应可以简化工艺、节省设备、无传统工艺的危险性和减少环境污 染等。近年来，酶催化化学反应越来越受到人们的广泛关注。 目前，可用于酶催化法合成苯胺类聚合物的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、漆酶、 大豆过氧化物酶等。其中，HRP己被最为广泛地应用于酶催化化学反应。可以预期，HRP 在催化氧化合成聚苯胺类化合物方面具有潜在的应用前景，利用HRP催化氧化苯胺类 化合物发生聚合反应是合成聚苯胺类化合物的极具魅力的选择。HRP可以催化氧化苯胺 类化合物，并可在水相或非水相溶剂中催化苯胺类化合物发生聚合反应，合成聚苯胺类 化合物，HRP催化苯胺类单体聚合反应是在H202作为氧化性底物存在下进行的。然而， 令人遗憾的是：H舢是HRP的自杀性底物，在反应过程中抑制和灭活HRP，制约了酶催 化聚合法在实际生产中的应用。目前，人们已经在反应方式上作了许多有益的探索研究， 但仍未能从根本上解决这一问题。我们认为从分子水平上改造HRP分子的结构和性能， 提高HRP的H202耐受性，使其适应在非生理条件下催化氧化苯胺类化合物发生聚合反 应的要求，是解决这一问题的一条新的有效途径，并将为探索酶催化聚合反应在实际生 产中的应用提供科学依据。 酶分子定向进化是一种在试管中使酶发生特定结构和功能改变的基因操作技术。 酶分子定向进化的基本策略是随机突变，定向筛选。这是一种非常有效且接近于自然 进化的酶工程研究新策略。它不仅能使酶进化出非天然特性，而且能使酶进化产生具 有多项优化功能，进而发展和丰富酶类资源。20世纪90年代以来，随着易错PCR技 术和DNA改组技术的出现，酶分子定向进化技术和策略才日趋成熟和完善。迄今为止， 人们已经成功地获得了几十种进化酶，并应用于不同领域，如进化的脂肪酶、蛋白水 解酶、纤维素酶等。由此可见，利用酶的定向进化技术可以从分子水平改造天然酶分 珊 辣根过氧化物酶基因的表达，进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究 子的结构和构造新的非天然的酶分子，从而改变酶的活性、稳定性和底物专一性等性 能，使其更好地适应体外非生理条件下催化化学反应的要求。目前，有关过氧化物酶 进化研究只有少量相关文献报道。1999年Cherry．J．R等研究进化了真菌过氧化物酶， 进化的真菌过氧化物酶热稳定性和氧化稳定性分别提高了174倍和100倍。2000年 Morawski．B等在大肠杆菌和酿酒酵母中进化了辣根过氧化物酶，进化的辣根过氧化物 酶对2，2，．连氨基．2(3．乙基．并噻唑啉．6)铵盐(ABTS)催化活力提高了5A倍。 然而，这些研究成果均以催化氧化小分子化合物(如，ABTS)发生化学反应为进 化目标，而以催化氧化合成聚苯胺类导电聚合物为目标的硼冲进化研究尚未见报道。 我们将分子生物学、组合化学及酶分子体外定向进化的方法和技术应用于聚苯胺类导电 聚合物的酶催化合成，以催化苯胺类化合物发生聚合反应为目标进化HRP。从分子水平 上，改造HRP的结构和性能，提高HRP在催化苯胺类化合物聚合反应过程中的Hz魄耐 受性，并利用毕赤酵母分泌表达进化HRP，研究进化HRP催化苯胺类化合物发生聚合 反应的性质、动力学及聚合物的性能，为瑚姆催化苯胺类化合物聚合反应在实际生产 中的应用奠定基础。 二、研究内容及结果 1．从辣根(ArmoracJa 析检测。HRP基因是真核生物基因，为此，首先从辣根侧根中提取获得了辣根总RNA， 琼脂糖凝胶电泳及紫外检测证明提取的辣根总RNA符合要求。而后采用RT—PCR技术获 HRPC3基因。经琼脂糖凝胶电泳检测获得的DNA片段大小约为1Kb，与预期结果一致。 TOPIO。 质粒pPICZa-A-hrp成功地转化了E．coli酶切法分析结果及测序分析结果表 对，其同源性达99