农杆菌介导的禾谷镰刀菌与瓜类炭疽菌转化及其致病性突变体初步筛选.pdfVIP

摘 要 引起的赤霉病是麦类作物的重要病害，造成大小麦的严重减产，产生的毒素影响 粮食品质。瓜类炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)引起的炭疽病是西瓜、黄瓜 上主要的叶部和瓜果病害。但是，目前对这2种重要病原真菌致病性分子机理的 认识还很有限。利用功能基因组学技术筛选分离致病性突变体，并克隆鉴定致病 性相关的关键功能基因，可加速对禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌生物学及其致病机理 的认识。本研究旨在构建一个适合真菌遗传转化、带有报道基因的双元载体，建 立和优化农杆菌介导的禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌转化体系，创建禾谷镰刀菌和瓜 类炭疽菌的T-DNA插入突变体，分析转化子的形态特征，筛选和初步分析致病性 突变体。 为了构建一个带有报告基因、适用于农杆菌介导真菌转化的双元载体，我们 nidulans 构建了一个Aspergillus 长，而且能表达GFP和GUS等报告基因活性。 经过对农杆菌与真菌孢子共培养时间、农杆菌和真菌孢子的浓度、抗生素种 类及其使用浓度等因子的优化，我们建立了农杆菌介导的禾谷镰刀菌和瓜类炭疽 菌的转化体系。用含25 等体积真菌孢子混合，25C振荡培养24h，再涂布于含100 MM固体培 I_Lmol／LAS 养基上的尼龙膜，24℃黑暗培养24h，洗下尼龙膜上的农杆菌和孢子混合液，涂 布到含有50}tg／ml氨苄青霉素、200 I-tg／ml潮霉素PDA平板 pg／ml头孢霉素和200 刀菌T．DNA插入转化子和150～200个瓜类炭疽菌T-DNA插入转化子。 对所获得的潮霉素抗性转化子进行了分子鉴定以及报告基因表达水平检测。 PCR检测表明，所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到双元 已经整合进禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌的基因组中。显微镜观察显示，所有转化子 的菌丝和孢子中都能观察到GFP荧光。GUS染色结果也表明，转化子表现为GUS 染色阳性。转化子菌株经过连续继代培养后仍然稳定，能在含潮霉素的培养基上 生长，并能观察到GFP荧光。 57等禾谷镰刀菌转化子的菌落颜色发生变异，菌落呈淡黄色或灰色，而野生型菌 落为淡粉红色：FG．5、12和30等禾谷镰刀菌转化子的菌丝生长和孢子萌发显著 降低；FG一56禾谷镰刀菌转化子的大型分生孢子比较直、宽，且两端钝圆。采用 大麦麦穗注射接种法测定禾谷镰刀菌T．DNA插入转化子的致病性，筛选发现 75和80等5个转化子丧失致病性。此外，我们也筛选到1个瓜类炭疽菌T．DNA 插入转化子TJ．22致病性显著下降。目前我们正在对初步筛选获得的禾谷镰刀菌 生长减慢、丧失致病性转化子进行进一步的鉴定，并运用TAIL．PCR分离克隆 T．DNA插入区域的侧翼序列。 本研究建立的农杆菌介导转化禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌体系，为进一步构建 大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆 鉴定奠定了基础。 关键词：禾谷镰刀菌，瓜类炭疽菌，T-DNA插入突变，农杆菌介导遗传转化， 致病性突变体 Transformationof Fusarium AgrobacteriumTtumefaciens-mediated GramineaumandCoiletotrichum and Lagenarium Prelimnary forTheir Mutan缸 ScreeningPathogenicity Abstract