真蛸热休克蛋白90(HSP90)两亚型基因的克隆和表达的研究.pdf

摘要 摘要 随着渔业资源需求量的逐渐增加，世界头足类的渔获量也随之逐年增加，一 些重要经济物种如金乌贼(Sepia 等由于过度捕捞导致物种资源量急剧减少，供求关系严重失衡。头足纲八腕目真 蛸(Octopusvulgaris)基于其营养价值高、生长速度快、养殖周期短的优点成为 当前的重要养殖对象，迅速在头足类渔业资源中占据了重要地位，并作为资源恢 复的重要目标受到了广泛关注。真蛸耐温性较差，最适生长温度15～23℃，在 高温环境下真蛸的存活率大大降低，水温超过26℃时则停止生长。为了解温度 shock 应激对真蛸生长的影响，本文对真蛸热休克蛋白(heat protein，HSP)90 的基因克隆和表达分析进行了全面和深入的研究。 热休克蛋白(HSP)是一类高度保守的蛋白，HSP90作为热休克蛋白家族重 要的分子之一，在机体组织受到各种应激刺激时，均通过产生HSP90来增强细 胞对损害的耐受能力，可快速短暂的保护细胞，强化细胞的修复功能并提高细胞 对应激的耐受水平。 本文采用常规PCR、SMART-RACE、GenomePCR等方 Walking、Real．Time 法从真蛸肝组织中克隆获得HSP90的2个亚型，通过对两亚型表达特征和系统 进化分析的对比研究将2个亚型分别命名为HSP90a和HSP9013，采用生物信息 学方法对其cDNA及基因序列和所编码蛋白的理化性质、系统进化关系等进行 系统的预测和分析，通过实时荧光定量PCR对HSP90在真蛸各个组织中mRNA mRNA表达量变化进行了表 表达水平以及在不同温度条件下特定组织中HSP90 达变化分析，实验结果总结如下： 1)真蛸HSP90a的cDNA全长2709 bp，5·非编码区(5·UTR)为119bp， 3啡编码区(3-UTR)为454 bp，开放阅读框(ORF)为2136bp，并编码1个由 711个氨基酸组成的蛋白。软件预测其蛋白理论分子质量为81．5ku，等电点5．09， 该蛋白质不含信号肽。HSP90a基因包含6个外显子和5个内含子。 83 bp，包括5·UTRbp，开放阅读 2)真蛸HSP90p克隆所得cDNA长2144 框部分2061bp，其中开放阅读框部分编码有687个氨基酸，预测其蛋白理论分 子质量为78．8ku，该蛋白N．末端存在1个由25个氨基酸组成的信号肽。 H 摘要 3)HSP90家族蛋白具有较高的稳定性，两亚型均存在保守的结构域，即N． 末端存在1个HATPase．C保守结构域，该结构域具有内源ATP酶活性，是ATP 结合部位。另两亚型均具有HSP90蛋白家族共有的5个保守信号序列区，其氨 基酸序列利用N-J法构建的系统发育树也分析验证了两亚型分别具备较高的保 守性且在进化关系上存在一定的相似性。 4)实时荧光定量PCR技术分析HSP90两亚型在真蛸各组织中的时空表达 模式，结果显示两亚型基因广泛分布于不同组织中，但在不同组织中存在表达差 异性。两亚型基因在不同组织中呈现比较相似的表达规律，借助与参照基因 13-actin的基因表达量对比显示，两亚型基因均在肝组织中表达量最高，性腺组织 和脑组织中次之。温度应激条件下两亚型的表达趋势呈现不同的变化规律，其中 HSP90a随着应激温度的不断升高，在肝和鳃组织内的基因表达量与温度应激呈 现正相关关系，但在超出临界温度时表达量急剧下降。HSP9013则随着温度的升 高基本呈现相对稳定的表达水平。根据两亚型基因在温度变化条件下呈现出来的 表达量差异，推测HSP90a在真蛸遭受高温应激时参与了免疫防御过程并发挥了 重要的保护作用，而HSP901B则主要在维