F3#39;#39;H基因超表达载体构建及转化菊花的初步研究.pdf

摘 要 花色是菊花的主要观赏性状之一，传统的菊花花瓣颜色不仅有黄、白、紫、红、粉、 雪青等多种颜色，还有各种奇异的花色类型，比如双色、间色和变色花等。但是却独缺 蓝色系菊花。在蓝色花形成的相关因素中，一个关键的因素是飞燕草色素的积累，所以 编码飞燕草色素的F3’5’H 基因也被称作“蓝色基因” 。因此，通过生物工程技术将F3’5’H 基因导入菊花，开辟了培育蓝色菊花的一个新途径。本研究主要研究成果： 以矮牵牛、瓜叶菊和飞燕草为实验材料，从中克隆出了各自的F3’5’H 基因，并从 矮牵牛中克隆得到了增强F3’5’H 基因表达的difF 基因，它编码细胞色素b5 。将这些基 因构建成超表达载体，并转化LBA4404 和GV3101 两种农杆菌，分别用于菊花和拟南 芥的遗传转化。 选择露地栽培和组培无菌苗两类菊花为侵染受体，露地栽培菊花品种为兼六香和红 菊，无菌苗菊花品种为粉球和翻云彩桂。通过查阅文献，设计出较适合的三种不同激素 配比的培养基，简化了工作量，也获得了各个菊花品种较为适合的培养基类型。从而初 步建立起了菊花再生体系。 通过实验初步获得了农杆菌介导转化菊花的遗传转化体系：外植体在预培养3 天后， 将其放入OD600=0.5 的相应农杆菌LBA4404 菌液中浸染8-20min，再共培养3 天、延迟 筛选3 天。以250mg/L Carb 为抑菌浓度，10mg/L Kan 为抗性筛选浓度。并且Carb 在愈 伤继代时降至100mg/L，Kan 在生根时降至5mg/L 。 除了常规的遗传转化体系，本实验还尝试了以高度分化的花瓣为外植体，诱导愈伤 组织，再以愈伤组织作为受体进行侵染。实验发现，此方法更易转化成功，而且 PCR 初步检测时目的条带很亮，说明转化效果较好。 本实验采用了 4 个菊花品种，3 个 F3’5’H 同源基因及转化的农杆菌菌株组合： LBA4404-矮牵牛Hf1 、LBA4404-Hf2 和LBA4404-瓜叶菊F3’5’H ，共12 个组合。除了 LBA4404-Hf1 侵染翻云彩桂的组合外，其它11 种组合进行PCR 初步鉴定均显示有目的 片段大小的条带，推测获得了抗性愈伤。目前为止，只有LBA4404-瓜叶菊F3’5’H 侵染 粉球这个组合获得了转化苗，共21 个株系，进行PCR 鉴定发现有 14 个株系扩增出了 目的片段大小的条带，阳性检出率较高，达到了66.6% 。 在培养过程中出现了一批蓝紫色愈伤，对其进行 PCR 初步鉴定及提取色素测其吸 I 收峰，并进行酸碱测试。根据实验结果推测，这可能是由于转基因表达后，飞燕草色素 积累所致。 同时，还做了农杆菌介导转化拟南芥方面的实验，以期为F3’5’H 基因的功能研究 提供基础材料。 关键词：F3’5’H ，转化，菊花，组织培养 II ABSTRACT Chrysanthemum cultivars have a rich range of color variations, including yellow, white, violet, red, pink, and lilac. More exotic colorations can also be found, yet nobody has successfully created a blue chrysanthemum cultivar. Research indicates the accumulation of delphinidin is a key factor in the formation of blue flowers, thus the delphinidin encoding gene F35H is known as a Blue Gene. Inserting F3’5’H into the gene sequences of chrysanthemum cultivars may therefore yield blue flowers. The main results of the examination: We extracted F3’5’H gene se